人脂肪组织基质血管组分的分离培养
【关键词】 脂肪组织; 细胞外基质； 细胞,培养的
ABSTRACT: Objective To establish a method for the isolation and culture of stromal vascular fraction(SVF) of human adipose tissue in vitro, which has the characteristics of stem cells. Methods Normal human abdominal subcutaneous adipose tissue was digested with collagenase Ⅰ and precipitated by centrifuge. The lowest layer cells were suspended and cultured with DMEM?F12. Immunofluorescence assay was used to determine the presence of the surface molecule marker CD31 and CD34. Results Immunofluorescence assay showed that about 70％ of the 2nd generation of cultured SVF cells were CD34 positive, but CD31 negative. Conclusion A rapid reproducible method was set up for the isolation and culture of SVF with the characteristics of stem cells from human adipose tissue, which possess clinical and research implication of stem cells.
KEY WORDS: adipose tissue; extracellular matrix; cells, cultured
传统的干细胞多取材于胚胎、骨髓和脐血,在伦理和供体来源方面受到一定限制。脂肪组织中基质细胞有多向分化潜能,可以作为干细胞的来源[1]。脂肪基质血管组分(stromal vascular fraction,SVF)即脂肪组织去除成熟脂肪细胞后,所获得的具有干细胞特性的基质细胞,相对而言有更大的优势。笔者探索更实用便捷、能够大量反复取样的SVF分离培养的方法,为人干细胞的研究寻求更便捷的来源,以期实现临床应用。
1 材料与方法
1.1 试剂 DMEM?F12培养基(含HEPES,美国Gibico公司),胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS,杭州四季青生物技术有限公司),牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,美国Amresco公司),CD31、CD34山羊源性单克隆抗体、猴抗山羊FITC二抗(美国Santa Cruz公司),L?多聚赖氨酸、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶(美国Sigma公司),25 cm培养瓶(美国Constar公司)。
1.2 方法
1.2.1 脂肪组织取材 在手术室无菌条件下,取正常体质量的腹部手术患者的腹部皮下脂肪,置于PBS缓冲液中。
1.2.2 脂肪组织消化 剪取脂肪组织约500 mg,剔除肉眼可见的血管及纤维部分,PBS冲洗3次,剪切成约1 mm×1 mm×1 mm的组织块,移入酶消化液4 mL中,内含1%BSA和0.1%Ⅰ型胶原酶,37 ℃消化60 min,消化期间每间隔5 min上下振荡1次。加入含15%胎牛血清的DMEM?F12培养基终止消化。
1.2.3 SVF处理
1.2.3.1 分离 80目(75 μm)网筛过滤组织消化液,去除未消化残余组织。将滤液移入新的10 mL离心管, 1 800 r/min离心10 min,可见离心管内液体分为4层。先吸除表层的脂滴和次层乳状的成熟脂肪细胞,再吸弃第3层上清液体,留下底层沉淀物SVF。加入含15%胎牛血清的DMEM?F12培养基1 mL吹打重悬,计数。
1.2.3.2 接种培养 在25 cm培养瓶中预先置入含15%胎牛血清的DMEM?F12培养基3 mL,覆盖培养瓶底面,将重悬的SVF细胞悬液移入培养瓶,细胞密度为20 000 cm-2。培养瓶置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养。6 h后换液,去除未贴壁细胞。此后每3天更换1次培养基。
1.2.3.3 传代 约1周后,细胞融合达到70%～80%时,可以传代。吸弃上清培养液,用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液浸润1遍,吸弃,倒置相差显微镜下观察见细胞回缩,间隙增大,吸弃消化液即加入含15%胎牛血清的DMEM?F12培养基终止消化,吸管轻柔吹打脱壁。移入10 mL离心管, 1 800 r/min离心5 min,弃上清,加入含15%胎牛血清的DMEM?F12培养基1 mL重悬。第2代细胞用于免疫荧光组织化学染色鉴定。
1.2.3.4 鉴定 采用免疫荧光组织化学染色鉴定。SVF细胞接种于24孔板内L?多聚赖氨酸预包被的盖玻片上,用于免疫荧光组织化学染色鉴定。室温下,37 ℃预热的PBS洗去培养基,4%多聚甲醛固定30 min,PBS漂洗5 min×3次。加入0.1%Triton?X溶液,室温作用30 min,PBS洗涤5 min。正常4%BSA于37 ℃封闭20 min。分别加入CD31、CD34山羊源性单克隆抗体(CD31检测内皮细胞,CD34检测干细胞),置4 ℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗5 min×3次,加入猴抗山羊FITC二抗,37 ℃作用45 min,PBS液漂洗5 min×3次。荧光显微镜下拍照观察。以PBS取代一抗为阴性对照。
1.3 结果 （1）细胞形态学。接种后细胞在6 h内大部分贴壁,24～48 h贴壁牢固。相差显微镜下,最初为小圆形,细胞大小不等,核浆比较大。2～4 d后可见细胞伸展,核呈椭圆形,较大,之间混有少数形态、体积不一的细胞。绝大部分细胞的生长呈现明显的聚集性(图1)。原代细胞约1周左右可以达到70%～80%融合。常规传代后,第2代以后的细胞约4 d左右即可以达到70%～80%融合。（2）免疫细胞学。第2代脂肪SVF约有70％细胞呈CD31阴性,CD34阳性,表明具有干细胞的特性(图2)。
SVF：脂肪基质血管组分. A:接种6 h首次换液后第1代SVF,细胞贴壁,多呈小圆形,大小不等,核浆比较大; B:接种48 h后第1代SVF,细胞较明显伸展; C:第2代SVF,细胞形态均匀,呈聚集性生长; D:第2代SVF,生长至70%～80%融合.
图1 人SVF细胞形态（略）
Fig 1 The morphology of cultured human SVF cells
2 讨论
从脂肪组织中去除成熟脂肪细胞后获得的具有干细胞特性的基质细胞,有不同的名称。由于其中除了有具干细胞特性的细胞外,可能还含有少许其他成分的细胞,是一种混合细胞群。笔者认为将这种细胞群称为SVF更为适合。研究表明,这种细胞具有很强的自我增殖能力[2]。在特定条件下,除了可以分化为脂肪细胞外,脂肪间充质干细胞还可以诱导分化为多种细胞,如成骨细胞、软骨细胞,以及肝细胞、胰岛细胞、神经元样细胞、心肌样细胞和血管内皮细胞等[3?4]。
对于SVF的细胞免疫表型,有不少研究进行了探索[3?6]。笔者选择细胞未分化标志CD34和内皮细胞标志CD31作为SVF鉴定的细胞表型指标,结果表明CD34阳性、CD31阴性。不可忽视的是,部分学者对其中某些SVF细胞表型包括CD34得出的结果不同,但获得的细胞同样具有多向分化潜能[7]。有研究发现,SVF细胞随着传代,CD34表达呈下降趋势。而被检测的SVF所传的代数不同,可能是不同研究出现某些SVF表型不同的原因之一[8]。
目前,体外分离培养SVF的方法主要为酶消化法。胰蛋白酶容易破坏细胞膜上的膜蛋白,损伤细胞。胶原酶主要针对细胞间质的胶原,而对细胞影响较小。鉴于组织取材于皮下脂肪,笔者选择Ⅰ型胶原酶,消化中加入BSA以进一步降低对细胞的损伤。由于脂肪组织以及成熟脂肪细胞会浮于消化液上部,造成实际作用于脂肪组织间质的胶原酶浓度快速降低,因此消化液的体积与脂肪组织的体积的比例要>2∶1。成熟脂肪组织容易破裂,释放出的游离脂肪酸等物质有一定的细胞毒作用[9?10],可能会对SVF的培养产生不利影响,因此,轻柔的上下振荡,尽可能减少脂肪细胞的破裂。鉴于0.2%的Ⅰ型胶原酶作用较强,本研究采用了0.1%的Ⅰ型胶原酶消化60 min的方法。消化后所获得的细胞数较多,细胞损伤较小。成熟脂肪细胞与SVF脂滴含量相差大,SVF离心沉淀,与漂浮于培养液上部的成熟脂肪细胞及少许脂滴分层。接种至培养瓶前,预置培养液覆盖瓶底,再移入离心重悬的SVF,可避免少许残余的成熟脂肪细胞或脂滴粘附于干燥的瓶底而混杂于SVF中。SVF细胞的生长呈现一定的聚集性。另外,通过塑料培养瓶贴壁法培养,红细胞等其他细胞通过换液传代逐渐去除,避免了应用氯化氨等红细胞裂解液对目的细胞可能的损伤。SVF原代接种6 h左右,基本贴壁,延长首次换液时间对SVF的纯度无益。
SVF:脂肪基质血管组分. 左:免疫荧光检测,右:同视野可见光相差显微镜图. A:PBS空白对照,细胞未见荧光; B:CD34抗原阳性,主要表达在细胞质及细胞膜,细胞核不表达; C:CD31抗原阴性,细胞未见荧光.
图2 人SVF细胞鉴定(免疫荧光组织化学染色)（略）
Fig 2 Immunofluorescence assay of human SVF cells
【】
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