APE1在肝细胞癌组织芯片的表达及临床病理意义
【摘要】 目的 探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)基因在原发性肝细胞癌(HCC)的表达及其与临床病理变化的关系。 方法 应用免疫组织化学方法,检测包含HCC及转移灶、癌旁肝硬化组织、癌旁慢性肝炎组织和正常肝组织的组织芯片中APE1的表达情况,结合临床病理资料进行统计分析。 结果 APE1在癌旁肝硬化组织、癌旁慢性肝炎组织和正常肝组织以细胞核表达为主,在HCC和转移灶组织以细胞质细胞核联合表达为主(P<0.01)。细胞质与细胞核染色强度均与HCC分级和转移密切相关(P<0.01),细胞质染色强度还与肿瘤包膜有无浸润有关(P<0.01)。 结论 APE1蛋白表达与HCC恶性表型有关,APE1蛋白过表达及细胞质表达的出现可能成为HCC预后不良的指标之一。
【关键词】 癌,肝细胞; 内切核酸酶类; 芯片分析技术; 免疫组织化学; 预后
ABSTRACT: Objective To study the association of apurinc/apyrimidinic endonuclease1(APE1) expression with clinicopathologic parameters in hepatocelluar carcinoma(HCC). Methods APE1 protein was detected in seven tissue chips, which contains HCC, para-carcinoma tissues, para-carcinoma choronic hepatitis tissues and normal liver tissues by immunohistochemistry. Detailed analysis of APE1 expression with clinicopathologic parameters was performed. Results APE1 was mainly detected in nuclei of para-carcinoma tissues, para-carcinoma chronic hepatitis tissues and normal liver tissues. While APE1 expressed in both nucleus and cytoplasm only found in HCC and metastatic tumor(P<0.01). A statistic significantty correlation between the positive degree of APE1 expression in both nucleus and cytoplasm with histological grade of HCC and metastasis(P<0.01). Furthermore, the positive degree in cytoplasm was correlated with capsule invasion(P<0.01). Conclusion The expression of APE1 is associated with the malignant phenotype of HCC. Overexpression and cytoplasm localization of APE1 can be used as a poorly prognostic marker for HCC.
KEY WORDS: carcinoma,hepatocelluar; endonucleases; microchip analytical procedures; immunohistochemistry; prognosis
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,其癌变是一个多步骤的渐进过程,与慢性肝脏损伤、肝炎和肝硬化有关。脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)是一种多功能的碱基切除修复途径的关键酶,具有脱嘌呤/脱嘧啶位点(AP位点)核酸内切酶(APE)活性,修复烷化剂、氧自由基、电离辐射等因素产生的DNA损伤。AP位点是DNA最常见的损伤位点之一,具有细胞毒性和基因毒性,若不能修复,可阻碍DNA的复制,导致基因突变、染色体微卫星不稳定性或细胞凋亡,最终可导致肿瘤的发生。APE1又名氧化还原因子1(Ref-1),可调节许多转录因子的DNA结合活性,参与细胞增殖、分化和细胞凋亡等多种关键的细胞反应。笔者采用组织芯片技术检测APE1在HCC、转移灶中的表达情况,分析APE1表达与HCC临床病理因素的关系。
1 对象与方法
1.1 对象
收集福建医科大学附属第一1998—2006年手术切除标本,其中HCC 126例,癌旁肝硬化组织(距癌组织<2 cm,镜下无癌)95例,癌旁慢性肝炎组织(距癌组织>5 cm)46例,肝内外转移灶29例,术前均未化疗及放疗。男性114例,女性10例,≥60岁28例,＜60岁96例。根据《常见肿瘤诊治规范》对肿瘤进行组织学分类:梁状型、假腺管型、实体型、硬化型。根据Edmondson组织学分级法进行病分级分为I~Ⅳ级,并判断有无包膜癌浸润和发生肝内外转移。根据肿瘤大小和数量分为3组:肿瘤直径<3 cm,肿瘤直径3~5 cm,肿瘤数量>2个或直径>5 cm。另收集正常肝组织5例,来源于1998-2006年福建医科大学附属第一医院手术切除的肝血管瘤的瘤旁肝组织。
1.2 方法
鼠抗人APE1 mAb(克隆号13B8E5C2,美国Novus Biologicals公司),工作浓度1∶18 000;Elivision plus免疫组织化学试剂盒(Kit-9901,福州迈新生物科技有限公司)。按照免疫组织化学Elivision plus二步法试剂盒说明操作,DAB显色。以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 制作组织芯片
根据研究目的设计点阵,选择典型区域在玻片和相应蜡块做标记。将本研究小组已制成的定位板盖在受体蜡块上［1］,按照定位板的点阵打孔,并从供体蜡块已标记的典型区域钻取组织,每个区域3个组织孔,转移到受体蜡块的承载孔。将组织芯片和周围蜡质加热融合。
1.4 结果判断
参照Bamberger等的半定量积分法［2］,在光镜下分别对阳性染色细胞数和染色强度进行判定。取表达最强的部分,按着色程度计分,无着色者为0分;浅黄色、略高于背景者为1分;棕黄色、明显高于背景者为2分;强染、棕褐色者为3分。同时按阳性细胞数计分,≤5％为0分,6％~25％为1分,26％~50％为2分,51％~75％为3分,>75%为4分。两项相加后分4级:0~1分为阴性(－),2分为阳性(＋),3~4分为中等阳性(?),5分以上为强阳性(?)。取各点的平均值综合判断。
1.5 统计学处理
采用SPSS 11.5统计软件分析,选用参数秩和检验对两个样本半定量等级资料进行分析,选用Kurskal-Wallis H 检验对多个样本半定量资料进行分析,选用Spearman秩相关进行指标间的相关分析。
2 结 果
组织芯片免疫组织化学封片后观察,部分组织有脱片,以每个病灶的3个点(至少有2个点)满足研究需求为标准,否则剔除该病例。126例HCC中2例由于组织脱落不能进行分析,其余124例均进入有效分析。
2.1 APE1定位表达
APE1蛋白在各组织的定位表达见表1。不同实验组APE1表达方式不同,在正常肝组织、癌旁肝炎组织和癌旁肝硬化组织,APE1主要以细胞核表达为主;在HCC和转移灶,APE1主要以细胞质和细胞核联合表达为主,显微镜下观察到细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒(图1A)。124例HCC中,44例为单纯细胞核染色,镜下仅在细胞质中出现棕黄色颗粒(图1B)。表1 各组APE1蛋白的定位表达（略）
2.2 APE1的半定量表达
各组细胞核和细胞质着色强度见表2。表2 各实验组APE1蛋白的半定量表达（略）
2.3 APE1表达与HCC临床病理因素的关系
随着病理组织学分级的升高,APE1细胞核阳性强度依次增高(rs=0.353,P=0.001),细胞质阳性强度亦有依次增高(rs=0.217,P=0.015)。包膜浸润组与包膜无浸润组相比,细胞质阳性强度具有显著差异(P<0.001),而细胞核阳性强度无差异。与无肿瘤转移组相比,肿瘤转移组中细胞核阳性强度明显升高(P=0.002)。细胞质阴性染色13例,占转移阳性组的44.8％,其他3种染色强度结果均低于阴性染色组。APE1表达与年龄、性别、肿瘤大小、组织学分型无关(表3)。表3 APE1蛋白表达与HCC临床病理特征的关系（略）
3 讨 论
本研究采用组织芯片和免疫组织化学相结合,检测APE1在HCC的表达,节约实验成本,大大提高实验效率,并保证实验条件的同一性,减少了因普通实验方法中分批、分次实验造成的实验误差,提高了实验结果的可靠性。同时,通过对手工制作组织芯片的方法进行改良,应用改良的打孔针和取材针,提高芯片制作的效率和质量,使检测APE1表达的实验系统更符合观察和进一步研究需要。
APE1是一个具有双功能的限速酶,既负责修复各种因素产生的AP位点,又通过保持许多转录因子(如p53、NF-κB、Pax-5、Pax-8、Hif-1、CREB、ATF和Hlf等)DNA结合区域特异性半胱氨酸的还原状态,维持转录因子的激活还原态,从而调节DNA结合活性,发挥重要作用。以上两种功能的异常均可导致肿瘤的发生。
在人体细胞中,APE1的表达可以细胞质型、细胞核型、细胞质/细胞核型3种模式存在。既往研究在卵巢癌、皮肤恶性黑色素瘤和结肠癌等多种肿瘤中发现,正常组织中APE1以细胞核表达为主,肿瘤组织以质核联合表达为主,APE1表达定位的改变与肿瘤的恶性转化密切相关［3-5］。本研究结果显示,质核联合表达方式比例在癌旁肝炎组织和癌旁肝硬化组织、HCC和转移灶组依次递增,正常肝组织未见质核联合表达方式,差别具有统计学意义,提示HCC APE1蛋白表达定位的改变,即从细胞核表达方式转变成细胞质表达方式,具有重要意义。细胞质表达方式的出现,可能与肿瘤的侵袭、转移有关。该结果与以往对肺癌、乳腺癌的相关研究结果一致［6-7］。
目前,对APE1的定位表达机制尚缺乏明确的论述。Tell等研究发现,各种导致APE1表达增强的应激因素(如UV、HBV、HCV和ROS等),可参与调控APE1在细胞内运输［8］。APE1在恶性肿瘤中的细胞质定位,可能是外来因子造成了线粒体内的DNA 损伤,在线粒体内出现了DNA AP 位点的修复。因此,推测APE1在恶性肿瘤中的定位机制与其所受的应激有关。本研究发现APE1在HCC中主要定位于细胞质,而HBx是引起APE1移位至细胞质的主要损伤因子,推测HCC 中APE1在细胞质表达与HBx损伤有密切关系。
Vittorio等发现,低分化肝细胞癌与高分化肝细胞癌相比,APE1细胞质染色强度明显增强［9］。在脑星形细胞肿瘤中发现,Ⅲ、Ⅳ级肿瘤的APE1核表达阳性强度显著高于Ⅰ、Ⅱ级,并与肿瘤复发有关［10］,进一步提示APE1的表达增强与肿瘤的恶性分化具有明显关系。本研究结果显示,细胞核表达阳性强度和细胞质表达阳性强度在各实验组中不同。在正常组、癌旁肝炎组、癌旁肝硬化组、HCC组和转移组同样分别呈依次递增趋势(P＝0.001)。因此认为APE1过表达与HCC发生、密切相关。进一步分析APE1表达水平与临床各病理参数之间的关系,结果显示APE1细胞核和细胞质阳性强度与肿瘤病分级、有无肝内外转移灶密切相关,后者还与包膜有无肿瘤浸润有关。APE1在细胞质和胞核过表达均与HCC的恶性临床表型有密切关系。
Puglisi 等研究结果显示,APE1蛋白的细胞质定位与肺癌、乳腺癌的不良预后有关［6-7］。由于本研究尚缺乏完整的随访资料,未能对APE1蛋白的表达与预后的关系进行直接论述,但本研究显示,APE1的细胞质表达与肿瘤的转移有关,且APE1过表达还与包膜侵犯和病理学分级有关系,而这些参数与HCC的侵袭力和预后均有非常密切的关系。因此推测,APE1蛋白的细胞质表达及细胞质+细胞核过表达可能与HCC的预后有关。
对HCC中APE1表达特点的研究具有重要意义,其细胞质表达方式的出现和阳性强度的变化,可作为判断HCC患者预后和肿瘤恶性表型的指标之一。
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