高效液相色谱法测定盐酸二甲双胍血药浓度及临床应用
【关键词】 盐酸二甲双胍 血药浓度 高效液相色谱法
盐酸二甲双胍(metformin hydrochloride,Met)是临床常用的口服双胍类降糖药,近年有一些缓、控释制剂上市。为了探讨其体内过程与临床疗效,笔者有关并加以改进[1?4],在实验室建立高效液相色谱法测定Met血药浓度,报道如下。
1材料和方法
1.1材料高效液相色谱系统(包括
510泵,996二极管阵列检测器,7725i 进样器,Empower数据处理系统,美国Waters公司);天平(AE?240,上海梅特勒?托利多有限公司);旋涡混合器(XW?80,上海医科大学仪器厂);石英亚沸高纯水蒸馏器(SYZ?550,金坛市丹阳门石英玻璃厂);台式高速离心机(TGL?16G,上海医用分析仪器厂)。
Met标准品(美国Sigma公司,批号113K0931);尿苷(Uri)对照品(上海化学试剂站分装厂,批号950906);IPR?B8离子对色谱试剂(天津化学试剂二厂,批号20070510);甲醇(国药集团上海化学试剂有限公司,批号T20060930,色谱纯),实验用水为三蒸水。
1.2色谱条件Nova?Pak C18色谱柱(3.9 mm×150 mm,4 μm);流动相为甲醇∶0.03 mol/L磷酸盐缓冲液∶三乙胺(18∶982∶0.1,含2.0 mmol/L IPR?B8离子对试剂,用氢氧化钾溶液调pH 6.2);流速0.9 mL/min;检测波长233 nm;柱温25 ℃;进样量20 μL。
1.3标准储备液配制(1)Met储备液:精密称定Met标准品33.03 mg,用三蒸水溶解并定容成10 mL,置4 ℃冰箱保存。(2)内标储备液:精密称定Uri 5.50 mg,用三蒸水溶解并定容成10 mL,置4 ℃冰箱保存。
1.4血浆样品处理取血浆样品1 mL,加入内标储备液50 μL并摇匀,加35%硫酸锌溶液50 μL及氯仿0.5 mL,涡旋振荡3 min,4000 r/min离心5 min,取上清液分析。
1.5标准曲线的制备精密吸取Met储备液加空白血浆适量,稀释成浓度分别为50,100,250,500,2 000,4 000 ng/mL的系列模拟含药血浆样品,按1.4方法处理。
2结果
2.1色谱行为本实验色谱条件下,分离度R=4.85,理论塔板数以二甲双胍n=1685,待测物色谱行为见图1。
2.2标准曲线将1.5分析结果以Met峰面积与内标峰面积之比(y)对浓度(x)进行回归分析,得回归方程y＝0.0540x+0.1773(r＝0.9997,n=6)。
2.3回收率试验精密吸取Met储备液加空白血浆,配成浓度分别为50,500,4 000 ng/mL的模拟血浆样品各5份,按1.4方法操作分析,考察方法回收率(表1)。
2.4精密度试验同回收率测定方法,配制50,500,4 000 ng/mL的血浆样品,按1.4方法操作分析,一日内不同时间5次,连续操作5日测定,考察方法精密度(表1)。表1Met回收率及精密度试验结果n＝5.Met:盐酸二甲双胍.表内数据为%.
2.5灵敏度试验取Met储备液适量加空白血浆稀释,同1.4操作进样,测得本法灵敏度为6 ng/mL(S/N≥3)。
2.6专属性考察对临床上可能与Met合用的药物格列齐特、列奈吡嗪、卡托普利、地高辛、罗红霉素及维生素B1进行考察,在本色谱条件下这些物质均不干扰Met的测定。
2.7临床应用Ⅱ型糖尿病住院患者分为2组,服用Met缓释片(江苏正大天晴药业公司,每片0.5 g)或普通片(中美上海施贵宝制药有限公司,每片0.85 g)。按医嘱服药>1周,分别于清晨服药前(谷)及服药后约2 h(峰)取静脉血,分离血浆1 mL,用本文建立的方法测定Met血药浓度(表2)。表2患者Met血药浓度测定结果Met：盐酸二甲双胍.
3讨论
3.1色谱条件的优化Met在固定相中的分配比小,调整流动相pH值或甲醇?磷酸盐缓冲液比例,均难以得到理想分离,加入十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸钠[2?4],可改善分离效果。笔者预试验时发现,流动相中加入SDS可产生浑浊、沉淀[3];本法流动相加入IPR?B8后分离效果好,但色谱柱平衡时间延长。
本实验采用甲醇?磷酸盐缓冲液(18∶982)为流动相,相对乙腈?磷酸盐缓冲液(40∶60)比较[2],由于甲醇毒性比乙腈小,有利于劳动防护。笔者曾试用苯妥英钠作为内标物分离效果欠佳,改用尿苷则分离度良好[3]。
3.2生物样品处理方法选择关于Met含药血浆样品处理,笔者采用硫酸锌/氯仿混合溶剂沉淀蛋白,提取方法回收率颇满意。经试验考察,本法比直接用乙腈沉淀蛋白回收率高12倍以上[1];比直接用高氯酸沉淀蛋白回收率高3倍以上[4];比依次用硫酸锌和氯仿分两次沉淀蛋白回收率高约1.2倍。
3.3临床血药浓度测定结果分析国外引用二甲双胍窗为0.465~2.5 mg/L(即Met 596~3206 ng/mL),患者肾功能损害或血氧不足时,血药浓度过高或即使在治疗浓度范围内,也可能发生二甲双胍相关性乳酸中毒症[5]。本文测定的6例患者Met血药浓度谷、峰值数据基本在治疗窗范围,但患者之间存在个体差异。由于在体内二甲双胍不经过肝脏代谢或胆汁分泌,而是主要以原形由肾脏排泄,对于伴有肾病或肾功能减退的糖尿病患者,应注意体内二甲双胍蓄积倾向,必要时应监测血药浓度或调整给药剂量。
【文献】
/[1/]赵立波,顾世芬,陈汇. 高效液相色谱法测定盐酸二甲双胍血药浓度/[J/]. 药学杂志, 2005,25(3):236?238.
/[2/]曲斌,杭太俊,江丽. HPLC法测定人血浆中盐酸二甲双胍的浓度及其在药动学研究中的应用 /[J/]. 中国新药杂志, 2004,14(7):637?640.
/[3/]李新春,杨玉芳,周燕文,等. 反相离子对色谱法测定人血浆中盐酸二甲双胍的浓度/[J/]. 广西医科大学学报, 2004,21(3):395?397.
/[4/]夏锦军,张宏文. 反相高效液相色谱法测定人血浆中盐酸二甲双胍的浓度/[J/]. 中国药房, 2003,14(8):478?479.
/[5/]Al?Jebawi A F,Lassman M N,Abourizk N N. Lactic acidosis with therapeutic metformin blood level in a low?risk diabetic patient/[J/]. Diabetes Care, 1998,21:1364?1365.
