转化生长因子β1信号传导抵抗在结直肠癌的作用
【关键词】 转化生长因子β 受体 转化生长因子β DNA结合蛋白质类 信号传导 结直肠肿瘤
结直肠癌的发生、是结肠黏膜上皮受遗传和环境等多种因素作用、多基因参与并经历了多阶段的演变过程。转化生长因子β1(TGF?β1)信号传导抵抗的发生在结直肠腺瘤癌变及最终发生转移过程中可能具有重要的作用[1]。TGF?β1是黏膜上皮细胞分泌的一种细胞因子,在体内多种组织中均可表达,对细胞增殖、分化和转化起着十分关键的作用,作为肿瘤抑制因子在结直肠癌变中发挥着重要的作用。其信号传导途径中的多种组成元件,如TGF?β受体(TβR?Ⅰ、Ⅱ)、Smads(mothers against DPP homolog )蛋白等失活性改变,致使信号通路阻滞,抑制细胞生长和恶变的功能丧失。笔者就TGF?β1信号传导抵抗的分子基础与结直肠腺瘤癌变的发生、发展的关系作一综述。
1TβR?Ⅱ的突变在结直肠癌中的作用
TGF?β1作为配体,首先与跨膜TβR?Ⅱ结合,活化的TβR?Ⅱ进而使TβR?Ⅰ的丝?甘氨酸(GS)序列结构域磷酸化,并进而与TβR?Ⅰ形成异源复合物。由于TβR?Ⅰ的磷酸化,从而可以招募下游Smads分子,调控细胞应答。TβR?Ⅱ基因定位于3q22,其编码蛋白的相对分子质量约为55 kD,为跨膜丝/苏氨酸激酶受体。该基因中含有一段10 bp的多聚A重复序列,编码受体胞膜外区的二个微卫星区,该重复序列发生插入或缺失都将导致TβR?Ⅱ变构而失活 [2]。而在TβR?Ⅱ的胞内激酶区域,常因高度保守位点发生错义突变,明显减低了丝/苏氨酸激酶的活性,自身无法磷酸化而引起信号传导中断。
有作者研究发现,在结直肠癌中TβR?Ⅱ的失活性突变率大约为20%～25%[3]，这说明TGF?βⅡ基因的缺失及变异将影响到受体蛋白的表达和功能。TβR?Ⅰ在此途径中可能也具有重要作用,但因TβR?Ⅰ基因突变引起TGF?β1信号传导抵抗仅见于少数非结直肠癌的研究报道中。上皮源性的肿瘤细胞表面丢失TGF?β受体和/或失去对TGF?β1抑制作用的敏感性,可能是其逃避负性生长调节的一个共性[4]。结直肠瘤细胞逃逸TGF?β1的负调控作用后,TGF?β1即通过自分泌和旁分泌作用而大量表达,促进基质血管的生成,即具有上皮?间质跃迁的特性,为肿瘤细胞的浸润和转移创造良好环境[5]。
2Smads蛋白失活性突变在结直肠癌中的作用
TGF?β1与跨膜受体结合,通过胞内Smads复合物的形成并在核?浆穿梭的介导,启动信号传导。各种Smads蛋白失活性突变,将导致信号传导阻滞,这是获得性TGF?β信号传导抵抗的另一常见机制[1]。
2.1Smads蛋白的种类、结构及各自功能在哺乳动物中已经分离鉴定的Smads蛋白有8种。根据各个因子在TGF?β1信号传导中所起的不同作用分为3个亚族:(1)受体激活型Smad(R?Smad),在体内作为TGF?βⅠ型受体底物的是Smad2、3;(2)共同调节型Smad(Co?Smad)即Smad4,能与所有活化的Smad蛋白形成异聚复合体,参与TGF?β信号传导;(3)抑制型Smad(I?Smad)包括smad6、7,可与活化的受体或受体激活的Smads结合,抑制转录作用。其中,R?Smads和Smad4在氨基端和羧基端各有1个结构域:MH1和MH2 (mad homology regions 1，2)。MH1区的功能主要为直接或间接地结合DNA,MH2区具有磷酸化位点SSXS基序,主要参与受体相互作用以及Smads的寡聚化,是信号传导的功能性结构域[6]。二者由富含脯氨酸的中间连接区(Linker)连接。而I?Smad的结构差异较大。Linker包含有MAPK的作用位点,还含有1个PY片段(Smad4除外),能特异性地与E3泛素连接酶相互作用,可能与Smads蛋白地降解有关[7]。
2.2Smads蛋白的核穿梭和基因转录调控各种Smad因子进入核内地方式并不相同。Smad2的核?浆穿梭需要其MH2结构域与核孔蛋白CAN/Nup214和Nup153相互作用;而Smad3的核输入则是由其MH1结构域中赖氨酸富集区的核定位系统NLS(nuclear localization signal)所赋予的;Smad4由于结构上有活跃的NLS系统和Linker的NES(nuclear export signal),从而能在核?浆持续地穿梭。I?Smad在TGF?β信号刺激时定位于胞核。
R?Smad/Smad4异聚体进入核内后,首先与靶基因启动区的特异性结合元件SBE(Smad binding element)结合,由于该位点亲和力较低,故Smads常与多种核内因子形成复合体被转运至特定启动子并与之牢固结合[8]。此外,靶基因的转录还需要转录辅助激活因子和辅助阻遏因子。I?Smad是信号传导的拮抗因子,能够牢固地与TβR?Ⅰ结合,使之无法将R?Smad磷酸化,从而与TGF?β1协同发挥抑制作用。体内的局部因素和细胞内环境的变化决定了活化的Smads与某几种转录因子相互作用而导致不同的效应。
2.3细胞内Smads蛋白的降解由于Smads是TGF?β1信号传导途径的关键调节因子,胞内Smads蛋白水平的改变必将影响信号级联反应。泛素蛋白酶体通路(UPP)广泛参与细胞内Smads蛋白因子的降解。UPP是ATP依赖性的能特异降解胞内调控蛋白的主要途径,由泛素、泛素连接酶和26s蛋白水解酶复合体共3部分组成。在此通路中,E3连接酶对底物蛋白的识别和降解起关键作用。其中,Smurf1，2是E3连接酶中HECT结构域家族的成员,定位于细胞质,其功能涉及对Smads信号通路的调节[9]。
在TGF?β1信号刺激下,Smurf2能够通过与Smad2的脯?酪氨酸(PPXY)模序紧密结合,通过HECT结构域催化降解Smad2; Smurf1，2均能与Smad7蛋白PPXY模序直接结合,被招募至TGF?β受体复合物处,协同Smad7发挥阻断TGF?β信号传导的作用,同时自身也被泛素化而降解。而在Smad4分子的序列中没有PPXY模序,在当具有WW?HECT结构域的其他E3连接酶,如WWP1等与I?Smad共同存在时,Smad4与Smad7通过各自的MH2区相结合,由Smad7介导其多泛素化而降解[10]。
2.4基因序列水平的改变
2.4.1Smads基因编码序列的改变在结直肠癌中,有学者利用反义Smad4基因抑制内源性Smad4的表达,从而阻断TGF?β1的信号传导,证明了Smad4是此通路中的一个重要组成元件[11]。Miyaki报道,结肠腺瘤Smad4的突变率位0,结肠腺瘤癌变后Smad4的突变率上升位10%,而结肠癌伴转移后其突变率高达35%[12]。在癌细胞中Smad4通过错义、移码突变或整条染色体相关区域的缺失而失活。Smad4是人们研究最多,也是了解较为详尽的一种。在Smad4的MH2结构域中存在着一个突变密集区,编码第330~370的氨基酸序列,是频繁发生错义突变的区域[13]。而在MH1结构域中,通过各种形式的突变增强了MH1与同源MH2结构域间的亲和力,导致Smad4分子处于受抑状态,或与DNA结合能力明显降低。这样,Smad4基因的突变通过不同的机制导致了细胞对TGF?β1诱导的生长抑制和凋亡作用产生抵抗,造成结直肠肿瘤的始动。另有学者研究发现,Smad3的羧基末端的磷酸化位点(pSmad2/3C)改变也可能是结肠腺瘤癌变的机制之一。结肠腺瘤癌变后,JNK?依赖性Smad3中间连接区的磷酸化使Smad3在核内积聚,降低了Smad3与TβR?Ⅰ的接触机会,同时pSmad2/3C明显减少[14]。
2.4.2Smads基因启动子序列的甲基化使相关基因沉默Smad基因序列的突变,将使TGF?β1/Smad4信号传导受阻。然而, Onwuebusi等通过实验对Smad4基因编码的11个外显子测序后,并未发现存在基因序列上的突变。随后又对Smad4的启动子序列进行甲基化分析,却发现启动子序列的异常甲基化与Smad4蛋白的表达缺失明显相关,并推测基因表观修饰方式使基因处于沉默状态,抑制了基因表达,阻碍了TGF?β1/Smad4信号传导[13]。
DNA甲基化是基因表观修饰的方式之一,甲基化能关闭某些基因的活性,而去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达,这种DNA修饰方式并没有改变基因序列,但却调控了基因的表达[15]。DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶的作用下使CpG二核苷酸的5’?端胞嘧啶转变为5’?甲基胞嘧啶。在抑癌基因的启动子区域和/或第一外显子区存在较密集的CpG岛,当结直肠肿瘤发生时,CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态,以致染色体螺旋程度增加,抑癌基因处于沉默状态,表达产物丢失[16]。
3展望
TGF?β1调控作用的发挥依赖于其受体及胞内中介分子的完整性,若TβR?Ⅱ、Ⅰ基因突变、Smads分子变构、降解,均将出现TGF?β1/Smad4信号途径的抵抗。近年来,虽然人们对结直肠腺瘤癌变的发病机制进行了多方面的探索,但仍有许多问题尚未解决,特别是早期发生的机制还不很清楚。TGF?β1/Smad4信号传导途径的深入研究,将为结直肠癌的早期诊断、基因和预后判断提供分子生物学上的理论依据。
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