两种慢性内脏痛模型造模效果比较
【摘要】 目的比较大鼠新生期结直肠刺激和新生期母婴分离两种模型的造模效果,评价适用于慢性内脏痛研究的模型。方法雄性新生Sprague?Dawley(SD)大鼠,随机分为结直肠刺激(CI)组、母婴分离(MS)组和对照组。CI组于出生第8~14天每天进行结直肠刺激,MS组于出生第2~21天进行母婴分离,对照组不予处理。大鼠成年后以腹壁回撤反射(AWR)评分、痛阈测定、腹外斜肌放电(EMG)幅度等指标评价其内脏痛觉敏化程度。结果CI组、MS组的AWR评分、EMG幅度均显著高于对照组(P<0.05),痛阈测定显著低于对照组(P<0.05),但两模型组各项指标比较差别无统计学意义(P>0.05)。结论大鼠新生期结直肠刺激和新生期母婴分离两种造模方法都可引起成年大鼠的内脏痛觉敏化,造模效果基本无异,均适用于慢性内脏痛的研究。
【关键词】 肠易激综合征 慢性病 内脏 疾病模型 动物 疼痛
慢性内脏痛是临床常见病,同时亦是肠易激综合征(IBS)等很多疾病的临床表现之一。近年来研究认为慢性内脏高敏感(慢性内脏痛)是IBS胃肠动力紊乱的原因,因此受到了国内外学者的广泛关注。目前用于急性内脏痛研究的模型比较成熟,而慢性内脏痛却缺乏稳定可靠的动物模型,因此其研究一直滞后于急性内脏痛和躯体痛。大鼠新生期结直肠刺激(CI)以及新生期母婴分离(MS)是目前有报道用于研究慢性内脏痛的两种模型[1?2],笔者对两种模型的造模效果进行比较,以评价适合用于慢性内脏痛研究的模型。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物及分组清洁级雄性新生SD大鼠3窝,每窝10~12只(福建医科大学实验动物中心提供,许可证号SCXK[闽]2004?0002)。随机将3窝新生鼠分为CI组、MS组和对照组。
1.1.2仪器20 mm×2.5 mm人血管重建气囊(Medtronic AVE,美国Santa Rosa公司);多道生理信号采集处理系统(RM6240BD,成都仪器厂);自制乳胶气囊[1]。
1.2方法
1.2.1模型建立
1.2.1.1CI组大鼠体质量15~18 g,于出生后第8~14天每天上午用20 mm×2.5 mm人血管重建气囊给予梯度压力的结直肠扩张,气囊连接检压计控制压力,每天扩张1次,持续1 min。第8~10天每天扩张前予以生理盐水0.3 mL灌肠;扩张压力第8~10天为40 mmHg（1 mmHg=133.3 Pa），第11~12天为60 mmHg,第13~14天为80 mmHg。出生后第22天断奶,正常分笼饲养。
1.2.1.2MS组大鼠于出生后第2~21天,每天上午与母鼠分开放入另一笼中,移至另一邻近房间,保持环境温度在(32±0.5)℃,3 h后放回最初笼中与母鼠团聚。出生后第22天断奶,正常分笼饲养。
1.2.1.3对照组出生后不给予任何处理,与前两组同时断奶,在相同环境中正常饲养。
1.2.2模型评价指标大鼠成年后(出生后60 d),体质量约250 g,剔除过轻或过重者,每组8只,双盲法检测。实验时保持安静,室温维持在25 ℃左右。
1.2.2.1腹壁回撤反射(AWR)评分大鼠实验前禁食不禁水18 h,乙醚吸入麻醉,将带有乳胶气囊(直径2.5 cm,长6 cm)的导管经肛门插入直肠,使气囊尾端距离肛门1 cm,用胶带固定导管于鼠尾,导管经三通管连接注射器和检压计。将大鼠放入有机玻璃观察箱(20 cm×6 cm×8 cm),待其醒来并适应环境后进行直结肠扩张(colorectal distensions,CRD),扩张压力分别为20,40,60,80 mmHg,各压力持续20 s,间隔4 min。根据大鼠反应进行AWR评分。评分标准为[2]:0分:无明显反应;1分:短暂的头部运动后停止;2分:腹部肌肉收缩;3分:腹部收缩并提起;4分:弓背并抬起骨盆。各压力重复作3次扩张并评分,取3次评分的平均数作为该压力下的AWR评分值。
1.2.2.2痛阈测定以每次5 mmHg的递增压力加压,观察大鼠在3 min内AWR评分基本稳定保持3分的最小CRD压力值为痛阈,重复测定3次,每次间隔4 min,取平均数作为痛阈[3]。
1.2.2.3腹外斜肌放电(EMG)大鼠实验前禁食不禁水18 h,麻醉并置乳胶气囊于直肠(方法同1.2.2.1),仰卧位固定,将银丝双极电极插入腹股沟韧带上方距中线1.5 cm的一侧腹外斜肌上,待其清醒并适应环境后记录不同CRD压力下腹外斜肌放电活动。CRD压力分别为20,40,60,80 mmHg,各压力持续扩张20 s,间隔4 min。
1.2.3组织学检查颈椎脱臼处死大鼠,取降结肠和直肠,10%福尔马林固定,石蜡切片,H?E染色,由病教师观察大鼠结肠组织结构的变化。
1.3统计学处理各组数据结果用x±s表示,以SPSS 13.0软件对样本均数进行t检验。P<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1AWR评分CI组在CRD压力20~60 mmHg、MS组在CRD压力20~80 mmHg均显著高于对照组(P<0.05);CI组和MS组的AWR评分差别无统计学意义(P>0.05,表1)。表1各组腹壁回撤反射评分n=8.1 mmHg=133.3 Pa.CRD:直结肠扩张. CI组:新生期结直肠刺激; MS组:新生期母婴分离. 与对照组比较,☆:P<0.05.
2.2痛阈CI组痛阈(20.42±4.25)mmHg,MS组(17.71±2.66)mmHg,均显著低于对照组(36.25±6.22)mmHg(P<0.05),CI组和MS组痛阈差别无统计学意义(P>0.05)。
2.3EMG平均幅值比较各CRD压力下腹外斜肌的平均放电幅度与基础放电幅度的差值,各组基础放电幅度差别无统计学意义(P>0.05)。CI组在CRD压力20~40 mmHg、MS组在20~ 60 mmHg的EMG幅度显著高于对照组(P<0.05),2组在各水平CRD压力下的EMG幅度差别无统计学意义(P>0.05,表2)。
2.4结直肠组织学CI组与对照组相较,结直肠黏膜无明显改变,黏膜下层结构完整,纤维结缔组织无增生,且无淋巴细胞、浆细胞浸润(图1)。表2不同CRD压力下各组腹外斜肌平均放电幅度
3讨论
3.1CI模型Al?Chaer等最早报道的CI模型制备选在大鼠出生后8~21 d内每天给予2次CRD 60 mmHg刺激,从而产生机械伤害性刺激以及一定程度的心理应激,导致成鼠出现临床IBS样表现[2];而本研究中CI模型则选在大鼠出生后8~14 d内每天上午给予1次CRD刺激,而且CRD压力随着乳鼠成长从40~80 mmHg逐渐增加,证明同样会诱发大鼠成年后持续性的内脏痛觉敏化,且组织学检查显示结直肠无明显的病理改变。应用梯度式渐进性的CRD,避免了造模早期过高的扩张压力可能对新生鼠肠壁造成的机械创伤(如结肠出血、破裂等),提高了造模的成功率。林国威等报道在大鼠出生后8~14 d内每天下午给予类似的CRD刺激亦会诱发成鼠内脏痛觉敏化[4]。上述方法造模时间虽有所不同,但并不会显著影响造模效果。
3.2MS模型本研究中，MS模型制备选在大鼠出生后第2~21天每天进行母婴分离3 h,利用这种早期负性生活事件造成新生期大鼠的心理应激,从而导致其成年后的内脏痛觉敏化[5],与Ren和Kalinichev等报道的MS模型造模效果一致[1,6],不同之处在于后者母婴分离的时间选择在出生后第2~14天,每天分离3 h。这两种方法分离时间虽有所不同,但这些早期负性生活事件都引发了一定强度的心理应激,均可引起大鼠成年后的内脏痛觉敏化。
3.3两种模型比较
3.3.1操作可控性CI模型制作对操作者的熟练程度有一定要求,初学者可能会因操作不慎而在造模过程中损伤乳鼠的结直肠,从而导致成年后大鼠结直肠的病改变,甚至引起乳鼠死亡。而MS模型制作方法简单、容易控制,即使是初学者造模也易成功。因此,MS模型在操作可控性方面占有优势。
3.3.2造模效果本研究用腹部EMG与AWR评分及痛阈等指标来评价内脏痛觉敏化程度[3?4,7],CI组的AWR评分在CRD 20~60 mmHg、MS组在CRD 20~80mmHg时显著高于对照组;2组痛阈均显著低于对照组;EMG幅度CI组在CRD 20~40 mmHg、MS组在CRD 20~60 mmHg时均显著高于对照组。2模型组AWR评分和痛阈以及EMG幅度差别无统计学意义,CI模型和MS模型均引起了大鼠成年后的内脏痛觉敏化,且两种模型效果差别无统计学意义。据称CRD压力<60 mmHg为非伤害性刺激,而≥60 mmHg则为伤害性刺激[7]。EMG幅度CI组在CRD 20~ 40 mmHg、MS组在20~60 mmHg时显著高于对照组,因此CI组只对非伤害性刺激的痛觉敏感程度显著升高,而MS组对非伤害性刺激和伤害性刺激的痛觉敏感程度均显著升高,提示两种模型的内脏痛觉敏感程度可能有所不同。
本研究发现,AWR评分与EMG反映的内脏痛敏结果基本一致。笔者认为,AWR评分直观易行,但作为一种半定量的测量方法,具有一定的主观性,实验者可通过双盲法尽量排除主观因素的影响;EMG测量较为客观灵敏,但由于是在清醒状态下记录,易受到大鼠自主运动的影响,因此AWR和EMG两种评价指标各有优势。
3.4模型选择慢性内脏痛的发病可能是多因素综合作用的结果,炎症、直肠机械性伤害刺激以及应激等因素均可引起慢性内脏痛[5,8?11]。CI模型从机械刺激和心理应激角度模拟了内脏痛的发病机制,MS模型主要从心理应激角度模拟了内脏痛的发病机制,2种模型最终都成功地诱发了大鼠成年后的慢性内脏痛,因此均可作为慢性内脏痛研究的模型。因2种模型模拟慢性内脏痛的发病机制各有侧重,笔者认为实验者可根据研究目的选择合适的模型,需要时可采用多种方式综合造模以尽可能接近IBS的病理状态。亦有学者提出通过心理和胃肠道生理因素的互动特征,利用条件刺激和非条件刺激来建立慢性内脏痛模型[12],其效果有待于进一步的研究证实。
【】
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