B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基因反式激活能力的比较

【摘要】  目的研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对多药耐药基因1(MDR1)反式激活能力的差别。方法PCR扩增B、C基因型HBV X基因并克隆于pcDNA3.1/HisC载体(重组载体分别为pcDNA3.1/HisC?XB及pcDNA3.1/HisC?XC)。以FuGENE6将重组表达载体转染HepG2细胞,采用融合表达的X?press多肽表位抗体,通过Western blot检测目的蛋白在不同时间段的表达。PCR扩增MDR1基因启动子并克隆于萤火虫荧光素酶报告载体pGL3?Basic(重组载体为pGL?MDR)。pGL?MDR分别与pcDNA3.1/HisC?XB或pcDNA3.1/HisC?XC共转染HepG2细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性。实验数据以SPSS 11.5软件分析。结果成功克隆X蛋白表达载体及MDR1报告载体。Western blot显示pcDNA3.1/HisC?XB或pcDNA3.1/HisC?XC在HepG2细胞中均能表达HBV X蛋白,以转染后48 h为最高。当pGL?MDR报告质粒与X基因重组载体或空载体质量比在1∶2~1∶4范围内,萤火虫荧光素酶在各转染细胞内的活性依次为pcDNA3.1/HisC?XB+pGL?MDR组>pcDNA3.1/HisC?XC+pGL?MDR组>pcDNA3.1/HisC+pGL?MDR组(对照组),且存在剂量?效应关系。结论B、C基因型HBV X蛋白对多药耐药基因均有反式激活能力,且B基因型强于C基因型。

【关键词】  肝炎病毒 乙型 癌 肝细胞 基因 病毒 反式激活（遗传学） 病毒蛋白质类 基因 MDR 药物耐受性

    X蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)最重要的致病因子之一,可反式激活多药耐药基因1(multidrug resisitance gene 1,MDR1)[1],与HBV相关性原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC)的高度恶性化及对化疗药物高度不敏感有关。研究表明B、C基因型HBV相关性HCC患者的临床表现及病理改变具有明显差别,而B、C基因型HBV X蛋白功能存在差异[2?4]。本研究拟通过分析B、C基因型HBV X蛋白对MDR1基因反式激活能力的差异,进一步探讨HBV基因型与致病性的相互关系。

    1材料和方法

    1.1材料

    1.1.1HBV DNA及肝细胞株pUC18?XB(含B基因型HBV X基因的pUC18重组载体)及pUC18?XC(含C基因型HBV X基因的pUC18重组载体)为本室保存。HepG2肝癌细胞株(美国组织细胞库,ATCC)。

    1.1.2主要试剂DMEM培养基、DNAzol、胎牛血清、Westernbreeze试剂盒、Anti X?press抗体、pcDNA3.1/HisC(美国Invitrogen公司);Expand High Fidelity PCR Kit、FuGENE6(美国Roche公司);phRL?SV40,pGL3?basic(美国Promega公司);质粒大量抽提试剂盒(美国Qiagen公司);Braford蛋白检测试剂盒(美国Bio?Rad公司)。硝酸纤维素膜(美国Amersham公司)。

    1.2方法

    1.2.1HBV X基因表达载体构建PCR扩增目的片段,所用引物为:

    上游(B基因)XbF:5’CGGGGTACCCAGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAAC 3’(下划线为KpnI位点)

    上游(C基因)XcF:5’CGGGGTACCCAGCTGCTCGG?

    GTGTGCTGCCAAC 3’(下划线为KpnI位点)

    下游XbcR:5’GCTCTAGATTAGGCAGAGGTGAA?

    AAAGTTGC 3’(下划线为XbaI位点)

    以pUC18?XB为模板,引物XbF及XbcR用于扩增B基因型HBx(XB),以pUC18?XC为模板,引物XcF及XbcR用于扩增C基因型HBx(XC)。扩增片段以XbaI及KpnI位点克隆于表达载体pcDNA3.1/HisC,经基因测序证实无误,所得克隆分别命名为pcDNA3.1/HisC?XB(含B基因型HBx)和pcDNA3.1/HisC?XC(含C基因型HBx)。

    1.2.2MDR1基因启动子报告载体构建以DNAzol抽提HepG2细胞染色体DNA,取0.2 μg作为模板进行目的DNA扩增,引物设计根据[1],序列为:

    上游MDRB:5’CGAGCTCATCCTGCACTGTTTAGGGAGGGTT 3’(下划线为SacI位点)

    下游MDRP3:5’CTAGCTAGCTTTGAGCTTGGAAGAGCCGCTACT 3’(下划线为NheI位点)

    以SacI、NheI位点克隆于pGL3?Basic。重组载体以双酶切鉴定并经测序证实目的基因正确无误。获得的重组载体命名为pGL?MDR。

    1.2.3HBV X蛋白检测Qiagen试剂盒抽提pcDNA3.1/HisC?XB、pcDNA3.1/HisC?XC、pcDNA3.1/HisC、pGL3?Basic及pGL?MDR。HepG2细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养,采用FuGENE 6转染,简要程序为:转染前24 h按6×105/60 mm平皿接种细胞;每个平皿DNA转染量为6.6 μg,FuGENE 6用量为10 μL;分别在转染后24,48,72及96 h各收取一平皿细胞。抽提蛋白并以Wes?tern?blot检测剪接特异性蛋白,简要程序如下:细胞经PBS洗涤3次后以RIPA裂解液(50 mmol/L Tris pH 7.2,150 mmol/L NaCl,0.1%SDS,0.5%DOC,1%NP?40,2 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaF)裂解细胞,离心获得上清。Bradford法(Bio?Rad)测定蛋白量,取等量蛋白30 μg,经15%SDS?PAGE凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素膜。Wes?tern?blot检测采用的一抗为与目的蛋白融合表达的标签抗体,即Anti X?press抗体(1∶4000),二抗、封闭液、洗液及检测系统采用Westernbreeze试剂盒。操作按试剂说明书。

    1.2.4质粒DNA共转染转染分3组,分别为pcDNA3.1/HisC?XB+pGL?MDR、pcDNA3.1/HisC?XC+pGL?MDR、pcDNA3.1/HisC+pGL?MDR。pGL?MDR与X基因重组载体或空载体的质量比例分别为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4及1∶5,各组均以海肾荧光素酶表达载体phRL?SV40作为内参照以平衡转染效率。报告质粒pGL?MDR另外做1份单独转染,作为启动子背景,用于相对荧光素酶活性的。以报告质粒pGL?MDR单独转染所测得荧光值,作为启动子背景,记为1,其余检测值与启动子单独转染的荧光值相除,得到1个相对荧光素酶活性值。实验重复5次。

    1.2.5荧光素酶活性检测DNA共转染48 h后,用预冷的PBS洗涤细胞2次,彻底吸弃残留的PBS,以1×Passive Lysis Buffer裂解液(美国Promega公司)500 μL裂解细胞,先检测胞内蛋白量,后各取等量蛋白100 μg用于海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性检测,操作步骤按试剂说明书。以海肾荧光素酶活性平衡校正萤火虫荧光素酶值。实验重复5次。

    1.3统计学处理使用SPSS 11.5软件包处理所得数据。

    2结果

    2.1重组载体构建PCR扩增获得长度约465 bp的B、C基因型HBV X基因(分别为XB及XC),并克隆于表达载体pcDNA3.1/HisC。重组载体经XbaI及KpnI双酶切鉴定及基因测序证实无误,所得克隆分别命名为pcDNA3.1/HisC?XB和pcDNA3.1/HisC?XC。PCR扩增获得长度约1 700 bp的MDR1基因启动子(+29~-1 730 bp),并克隆于荧火虫荧光素酶报告载体pGL3?Basic。重组载体以SacI及NheI双酶切鉴定(图1)并经测序证实目的基因正确无误。获得的重组载体命名为pGL?MDR。

    1:XB扩增产物; 2:XC扩增产物; 3~5:分别为pcDNA3.1/HisC、pcDNA3.1/HisC?XB及pcDNA3.1/HisC?XC以XbaI+KpnI双酶切; 6:MDR1基因启动子扩增产物; 7,8:分别为pGL3?Basic及pGL?MDR以SacI+NheI双酶切; M:分子量标准.

    2.2HBV X蛋白在HepG2细胞中表达X蛋白含154个氨基酸,相对分子质量约18 kD。在重组表达载体中,X蛋白与载体编码的40氨基酸多肽(其中含X?press表位)融合表达,融合蛋白的相对分子质量约23 kD。以抗X?press抗体进行的Western blot检测结果显示，pcDNA3.1/HisC?XB或pcDNA3.1/HisC?XC转染HepG2细胞24 h后可见目的蛋白表达,48 h达到最高,转染后96 h表达下降,此外,相同时间段XB及XC的表达强度无差别(XB表达检测,图2)。

    1:24 h; 2:48 h; 3:72 h; 4:96 h. pcDNA3.1/HisC?XB转染HepG2细胞转染后裂解细胞.

    图2Western blot检测HBV X蛋白在HepG2细胞中表达

    Fig 2Western blot analysis of HBV X protein expressed in HepG2 cells

    2.3B、C基因型HBV X蛋白对MDR1基因的反式激活能力不同pcDNA3.1/HisC?XB或pcDNA3.1/HisC?XC分别与报告质粒pGL?MDR共转染HepG2细胞,通过检测胞内荧火虫荧光素酶活性的高低,评价HBV X蛋白对MDR1基因的反式激活能力高低。由于Western blot结果显示X蛋白在转染后48 h表达量最高(图2),故选择该时间点裂解细胞并检测胞内荧光素酶活性，检测结果见表1及图3,配对t检验显示,对于1∶2~1∶4相同比例

    的pGL?MDR报告质粒与X基因重组载体或空载体,胞内荧火虫荧光素酶活性大小依次为pcDNA3.1/HisC?XB+pGL?MDR组>pcDNA3.1/HisC?XC+pGL?MDR组>pcDNA3.1/HisC+pGL?MDR组(对照组)(n=5,P<0.01),且存在明显的剂量?效应关系;当二者比例为1∶1和1∶5时(图3),pcDNA3.1/HisC?XB+pGL?MDR组与pcDNA3.1/HisC?XC+pGL?MDR组相同(n=5,P＞0.05),但均高于pcDNA3.1/HisC+pGL?MDR组(n=5,P＜0.01)。表1转染的HepG2细胞内相对萤火虫荧光素酶活性与pGL?MDR+pcDNA3.1/HisC?XB比较，#：P<0.01.

    3讨论

    HCC的临床特征是高度恶性化及对化疗药物高度不敏感,这与肝细胞过度表达MDR1基因有关。MDR1基因编码产物Pgp170(P170糖蛋白)可将亲脂类化疗药泵出胞外而导致细胞耐药。它由一种药物诱发,而同时对其它多种结构和作用机制完全不同的抗癌药物产生交叉耐药[1]。

    X蛋白是HBV最重要的致病因子之一,与HBV相关性HCC的发生、、侵袭、转移关系密切[5]。HBV X蛋白可反式激活MDR1基因[1],导致HCC高度恶性化及对化疗药物高度不敏感。笔者先前的研究表明HBV X蛋白的结构及对CMV启动子的反式激活能力具有B、C基因型特异性差异[4,6],本研究旨进一步探讨B、C基因型HBV X蛋白功能差异。转染结果显示,B、C基因型HBV X蛋白对MDR1基因启动子均有反式激活作用,且B基因型X蛋白要强于C基因型。

    HBV共有8个基因型(分别为A?H)[7]。B、C基因型HBV相关性HCC的临床表现及病理改变存在差异[2?3]:B基因型与50岁以下人群的HCC相关性更大,而C基因型引起的HCC在老年人中较多,上述差异的确切机制不明。由于MDR1基因的过表达除涉及到耐药外,也是癌细胞生物学行为进一步恶性化的指标。本研究提示，B、C基因型HBV X蛋白对MDR1基因反式激活能力的差别可能是造成上述差异的原因之一。

    需要指出的是,本研究只初步证实了B、C基因型HBV X蛋白对MDR1基因反式激活能力存在差异,造成这种差别的原因尚不清楚,笔者正采用基因置换及定点突变研究其确切机制。另外,目前尚未有HBV基因型与HCC耐药相互关系的报道,因此,B、C基因型HBV X蛋白对MDR1基因反式激活能力差别的临床意义有待进一步评价。

【】
  /[1/]Doong S L,Lin M H,Tsai M M,et al. Transactivation of the human MDR1 gene by hepatitis B virus X gene product/[J/]. J Hepatol, 1998,29(2):872 878.

/[2/]Kao J H,Chen P J,Lai M Y,et al. Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B/[J/]. Gastroenterology, 2000,118(2):554?559.

/[3/]Orito E,Mizokami M,Sakugawa H,et al. A case control study for clinical and molecular biological differences between hepatitis B viruses of genotypes B and C/[J/]. Hepatology, 2001,33(1):218?223.

/[4/]林旭,徐晓,黄清玲,等. B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白结构对反式激活能力影响/[J/]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2004,24(4):559?564.

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/[6/]Lin X,Xu X,Zheng D L,et al. Biological impacts of the "hot?spot" mutations on hepatitis B virus X proteins are genotype B and C differentiated/[J/]. World J Gastroenterol, 2005,30(10):4703?470.

/[7/]Kidd?Ljunggren K,Miyakawa Y,Kidd A H. Genetic variability in hepatitis B viruses/[J/]. J Gen Virol, 2002,83(6):1267?1280.