退变腰椎间盘组织细胞凋亡及相关基因Fas和Bcl?2蛋白的表达
【摘要】 目的观察髓核组织Fas和Bcl?2蛋白的表达,探讨其在腰椎间盘退变过程可能发挥的作用。方法采用原位DNA片断末端标记(TUNEL)和免疫组织化学方法,检测20例退变腰椎间盘(退变组)及6例正常腰椎间盘(对照组)髓核组织的细胞凋亡状态及凋亡相关基因Fas和Bcl?2的表达。结果退变组及对照组髓核组织细胞凋亡指数(AI)分别为(50.23±13.36)和(28.32±6.67)(P<0.05),Fas蛋白阳性细胞百分比(74.26±10.15)%和(41.72±4.62)%(P<0.01),Bcl?2蛋白阳性细胞百分比(55.37±13.65)%和(27.17±5.17)(P<0.01)。凋亡细胞越多,Fas和Bcl?2的表达越强。结论Fas和Bcl?2蛋白均参与腰椎间盘组织中细胞凋亡的调节,可能在腰椎间盘退变中发挥重要作用。
【关键词】 椎间盘 腰椎 细胞凋亡
1991年,Tompson用细胞培养方法观察细胞因子对椎间盘细胞增殖和细胞外基质更新的影响[1],国内外学者现已认识到细胞因子在腰椎间盘髓核细胞凋亡过程中起着重要的作用。有关细胞凋亡及凋亡相关基因在退变性疾病的发生及进展中所起作用越来越受到重视[2]。多种细胞因子可直接或间接影响髓核细胞的凋亡,如高水平NO可以促进髓核细胞凋亡,转化生长因子?β1可以抑制髓核细胞凋亡等[2?3]。笔者观察退变腰椎间盘组织细胞凋亡状态及凋亡相关基因Fas、Bcl?2的表达情况,探讨其在腰椎间盘退变过程的作用。
1材料与方法
1.1标本(1)退变组:退变腰椎间盘组织(L3～5)取自2003年12月～2004年12月住院手术的腰椎间盘突出症患者的髓核标本,共20例,男性13例,女性7例,年龄(45.20±15.72)岁(21～69岁)。纳入标准:有典型临床症状、体征及相应MRI表现,术后病理证实椎间盘组织明显退变。(2)对照组:正常腰椎间盘组织(L3～5)取自同期本院骨科脊柱创伤需手术的患者(术前均签订取材知情同意书),共6例,男性3例,女性3例,年龄(32.50±14.36)岁(24～56岁)。纳入标准:伤前无慢性腰背痛史,MRI无示椎间盘退变征象,术后组织学检查椎间盘组织无明显退变。
1.2方法
1.2.1原位DNA片断末端标记采用脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)介导的原位缺口末端标记法(TUNEL法),细胞核呈蓝黑色者为阳性细胞,即凋亡细胞。每例计数10个400倍视野,以平均100个细胞中含凋亡细胞个数为凋亡指数(AI)。
1.2.2免疫组织化学使用S?P免疫组织化学试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司),一抗为兔抗人Fas单克隆抗体和鼠抗人Bcl?2单克隆抗体。所有标本均在同一条件下采用链霉蛋白素?生物素法[LSAB(SP)法]进行免疫组织化学染色,各步骤间均用PBS洗片。阳性对照选用经病理检查确诊为淋巴瘤的病理石蜡切片,用PBS代替一抗为阴性对照。细胞质出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞,每例切片用400倍镜双盲法计数,细胞数不少于400个,并细胞阳性率(%)。
1.3统计学处理资料以x±s表示。采用Student?t检验和多重线性回归分析。
2结果
2.1腰椎间盘髓核组织中,Fas、Bcl?2蛋白表达在软骨细胞,其细胞膜及细胞质出现棕黄色颗粒状染色(图1)。腰椎间盘髓核组织中,凋亡细胞为软骨细胞,其细胞核呈蓝黑色。对照组与退变组腰椎间盘髓核组织中细胞AI、Fas与Bcl?2蛋白表达见表1。
2.2运用多重线性回归分析髓核细胞表达的Fas、Bcl?2蛋白与髓核细胞AI的关系,获得一多元线性回归方程:
Y＝0.671X1－0.124X2＋6.419
Y:髓核细胞凋亡指数(AI); X1、X2:髓核组织中细胞表达Fas,Bcl?2蛋白的阳性率.表1对照组与退变组腰椎间盘髓核组织中髓核细胞凋亡指数及Fas、Bcl?2蛋白表达程中各系数均不为零,回归方程有意义。又由于该方程相关系数的平方值为0.418,表示这两个自变量一起,可以解释因变量41.8％变异性。
3讨论
腰椎间盘长期受各种应力作用劳损较重,在压力、张力、扭转、震荡等反复作用下,椎间盘内压力增加,水分丢失,氧张力下降,细胞活力下降甚至死亡,基质成分如蛋白多糖、硫酸软骨素等减少,这些均促成腰椎间盘退变[5]。腰椎间盘退行性变是导致腰椎间盘突出症的基本病因,退变腰椎间盘主要病理改变为椎间盘细胞量减少及椎间盘基质的降解[6]。既往的研究表明,椎间盘中多种生长因子类保护性细胞因子生成及分泌的减少以及多种炎性损伤性细胞因子的增多,是造成髓核细胞直接或间接大量凋亡的重要原因,并最终导致椎间盘退变甚或椎间盘突出。其中,Fas分子对髓核细胞的促凋亡作用已获得共识,但对于Bcl?2分子的作用却有不同观点[7]。
Fas蛋白又称为Apo?1或CD95,属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)/神经生长因子受体(NGFR)家族成员,广泛存在于多种组织细胞。一般认为,Fas蛋白分子中至少有3个与凋亡诱导功能密切相关的结构域:EXT、“死亡”域(DD)和调控区(RR)。Bcl?2存在于细胞中的线粒体外膜、核膜和内质网膜上。Bcl?2蛋白可抑制多种途径介导的细胞凋亡,其家族蛋白在细胞底物的调节中发挥着重要作用[8]。
Itoh等应用基因转移和表达技术发现,Fas系统与Bcl?2系统在诱导细胞凋亡中存在某种相互关系[10]。Mapara等的研究提示,Fas系统介导的细胞凋亡可能是通过Bcl?2表达的负调节来实现的[11]。相关研究发现,Fas介导的细胞凋亡系统与Bcl?2存在着一定的相互关系,但Bcl?2只能部分抑制Fas介导的凋亡作用[12?13]。本实验结果表明,随着退变腰椎间盘髓核组织中细胞凋亡增加,凋亡相关基因Fas及Bcl?2在退变腰椎间盘髓核组织中的表达率也升高。多重线性回归分析结果认为,Fas蛋白可促进髓核细胞凋亡,其表达的高低与髓核细胞凋亡严重程度呈正相关,且相关性较强;Bcl?2蛋白可抑制髓核细胞凋亡,其表达的高低与髓核细胞凋亡严重程度呈一定的负相关,但其相关性不强。因此,可能由于Fas蛋白等损伤性细胞因子的促凋亡作用强于Bcl?2蛋白等保护性细胞因子的抑制凋亡作用,最终导致髓核细胞向凋亡的方向。
【】
/[1/]Tompson J P,Oegema T R,Bradford D S. Stimulation of mature canine intervertebral disc by growth factors/[J/]. Spine, 1991,16(3):253?260.
/[2/]赵卫红,寿好长,闫福岭. 细胞凋亡/[M/]. 郑州:河南医科大学出版社, 1997:41?45.
/[3/]Furusawa N,Baba H,Miyoshi N,et al. Heriation of cervical of intervertebral disc immunohistochemical examination and measurement of nitric oxide production/[J/]. Spine, 2001,26(10):1110?1116.
/[4/]Maeda S,Kokubun S. Changes with age in proteoglycan synthesis in cells cultured in vitro from the inner and outer rabbit annulus fibrosus:responses to interleukin?1 and interleukin?1 receptor antagonist protein/[J/]. Spine, 2000,25(2):166?169.
/[5/]谢其杨,叶君健,胡志坚,等. 突出的腰椎间盘退变程度病初步研究/[J/]. 福建医科大学学报, 2002,36(1):20?22.
/[6/]Buckwalter J A. Aging and degeneration of the human intervertebral disc/[J/]. Spine, 1995,20(11):1307?1314.
/[7/]Gruber H E,Norton H J,Hanley E N. Anti?apoptotic effects of IGF?1 and PDGF on human intervertebral disc cells in vitro/[J/]. Spine, 2000,25(17):2153?2157.
/[8/]Reed J C. Double identity for proteins of the Bcl?2 family/[J/]. Nature, 1997,387:77.
/[9/]李增春,贾连顺,史建刚,等. 脊髓损伤后凋亡调控基因Bcl?2、Bax的表达及意义/[J/]. 矫形外科杂志, 2004,12(3):228?229.
/[10/]Itoh N,Tsujimoto Y,Nagata S. Effect of Bcl?2 on Fas antigen?mediated cell death/[J/]. J Immunol, 1993,151(2):621?627.
/[11/]Mapara M Y,Bargou R,Zugek C,et al. APL?1 mediated apoptosis or proliferation in human chronic B lymphocytic leukemia: correlation with Bcl?2 on cogene expression/[J/]. Eur J Immunol, 1993,23(3):702?708.
/[12/]彭黎明,王曾礼. 细胞凋亡的基础与临床/[M/]. 北京:人民卫生出版社, 2000:54.
/[13/]林金贵,叶君健,傅冷西. 细胞因子与腰椎间盘髓核细胞凋亡的关系/[J/]. 福建医科大学学报, 2005,39(增刊):47?49.
