胰岛素样生长因子?1和肿瘤坏死因子?α对C2C12骨骼成肌细胞增殖和分化的影响

【摘要】  目的观察胰岛素样生长因子?I(IGF?I)和肿瘤坏死因子?α(TNF?α)对体外培养的C2C12小鼠骨骼成肌细胞增殖、分化的影响。方法体外培养C2C12小鼠骨骼成肌细胞,分别采用IGF?I、TNF?α和 IGF?I+TNF?α干预细胞,以 MTT法、肌酸激酶(CK)活性测定法检测处理后的细胞在增殖、分化方面的变化。结果IGF?I组24,48和72 h增殖程度均高于对照组(P<0.05)，且增殖作用具有时间效应(P<0.05)。IGF?I组和TNF?α组CK活性均低于对照组(P<0.05),但随着时间延长IGF?I组CK活性呈升高趋势。结论IGF?I促进C2C12骨骼成肌细胞的增殖，延迟其分化；TNF?α抑制C2C12骨骼成肌细胞的分化。

【关键词】  胰岛素样生长因子?I 肿瘤坏死因子

    恶病质在严重创伤、严重感染、癌症及艾滋病病人中常见。肿瘤坏死因子?α(tumor necrosis factor?α,TNF?α)参与恶病质的发生、进程,是引起恶病质的主要细胞因子之一;具有抑制骨骼肌细胞蛋白合成,促进蛋白分解作用[1]。胰岛素样生长因子?I(insulin like growth factor?I,IGF?I)能促进全身组织细胞的增殖和生长,并具有胰岛素样作用；能抑制细胞凋亡,维持细胞生存,还能保护一些细胞株免受由TNF?α诱导的凋亡,如胎儿脂肪细胞、大鼠成骨细胞等[2?5]。笔者应用IGF?I和TNF?α处理体外培养的小鼠C2C12骨骼成肌细胞,观察IGF?I和TNF?α对C2C12骨骼成肌细胞增殖和分化的影响。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1细胞株C2C12小鼠骨骼成肌细胞株(医学院基础医学研究所细胞中心)。

    1.1.2试剂和仪器小鼠IGF?I、小鼠TNF?α(英国PeproTech EC LTD);胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS (美国HyClone公司);高糖DMEM培养液(美国Gibco公司);噻唑蓝(MTT, 英国Biomol公司);二甲基亚砜DMSO(上海化学试剂一厂);肌酸激酶(CK)活性测试盒(南京建成生物工程研究所);752型紫外分光光度计(上海分析仪器总厂);酶标仪(美国Biorad公司);相差倒置显微镜(日本Olympus公司)。

    1.2方法

    1.2.1细胞培养C2C12骨骼成肌细胞株置于含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养液,在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养。采用对数生长期细胞进行实验。

    1.2.2MTT法以浓度2.0×104 mL?1的细胞悬液接种96孔培养板中,每个实验组种9孔,每孔接种100 μL,培养12 h细胞贴壁后,吸弃培养液,按实验分组加入相应培养液100 μL继续培养。在24,48,72 h各个时相点的前4 h各取培养板1块,每孔加入浓度为5 mg/L MTT 50 μL继续培养4 h,吸弃上清液后向每孔加入20% DMSO 100 μL,振荡后在酶标仪上以490 nm波长测光密度（D）值。

    1.2.3CK活性测定以浓度5.0×104 mL-1的细胞悬液接种6.25 cm×4.0 cm的培养瓶,每瓶4 mL。培养12 h细胞贴壁后倒弃培养液,按实验分组加入相应培养液4 mL继续培养。在24,48,72 h各个时相点以0.25%胰蛋白酶消化收集各实验组细胞。用生理盐水(1 500 r/min,离心10 min)洗涤细胞2次,加双蒸水200 μL,超声处理使细胞破碎,以3 000 r/min ,离心10 min后取上清夜。采用CK测试盒比色法测定D值,根据已知一定浓度标准品的D值CK活性。

    1.2.4实验分组对照组:含2%FBS的DMEM;I组:含2%FBS的DMEM+IGF?I 100 ng/mL;T组:含2%FBS的DMEM+TNF?α 20 ng/mL;I+T组:含2%FBS的DMEM+TNF?α 20 ng/mL+IGF?I 100 ng/mL。

    1.2.6统计学处理数据以x±s表示。采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析。P<0.05为差别有统计学意义。

    2结果

    2.1细胞增殖C2C12细胞在含2% FBS+100 ng/mL IGF?I培养液培养72 h后光镜观察见图1。24,48,72 h检测IGF?I和TNF?α对成肌细胞增殖影响的结果见表1。细胞核较大,细胞紧密相邻,有方向性,细胞增殖活动旺盛,铺满培养瓶瓶底.

    2.2细胞分化24,48,72 h检测各组CK活性见表2。

    3讨论

    IGF?I是一类广泛存在于机体多种组织中的蛋白多肽,主要由肝脏合成,在体内受生长激素的调节。它能促进全身组织细胞的增殖和生长,增加细胞生长速度,并具有胰岛素样作用。IGF?I促进细胞的增殖与其具有潜在的有丝分裂原功能有关。增殖的细胞必须进入细胞周期,IGF?I促进细胞增殖作用通过促进细胞从G1期向S期转变[6]。本实验证实IGF?I可促进C2C12成肌细胞的增殖。

    低血清DMEM培养基可以诱导成肌细胞退出细胞增殖循环周期,促进其分化 [7]。本实验提示,用含2%FBS培养液低血清DMEM培养基可以诱导C2C12骨骼成肌细胞的分化。通过与低血清的对照组比较,IGF?I并无促进C2C12成肌细胞分化的作用。但随着干预时间的延长,CK值逐渐增高(P<0.05),提示IGF?I可延迟C2C12细胞的分化。成肌细胞分化时要离开细胞的增殖周期[8],因此认表1不同时相点各实验组测定的吸光度n=9.I组:含2%FBS的DMEM +胰岛素样生长因子?I 100 ng /mL;T组:含2%FBS的DMEM+肿瘤坏死因子?α 20 ng/mL;I+T组:含2%FBS的DMEM +肿瘤坏死因子?α 20 ng/mL+胰岛素样生长因子?I 100 ng/mL.与对照组比较,☆:P<0.05;与组内48 h比较,#:P<0.05.表2不同时相点各实验组测定肌酸激酶值n=4.I组:含2%FBS的DMEM +胰岛素样生长因子?I 100 ng/mL;T组:含2%FBS的DMEM+肿瘤坏死因子?α 20 ng/mL;I+T组:含2%FBS的DMEM +肿瘤坏死因子?α 20 ng/mL+胰岛素样生长因子?I 100 ng/mL.对照组比较,☆:P<0.05;与组内48 h比较,#:P<0.05;组间比较,△:P<0.05.

    为IGF?I促进C2C12成肌细胞增殖时,使细胞进入分裂周期,从而抑制了成肌细胞的分化。进入分化的成肌细胞是不可逆的,最终可导致肌管的形成。成肌细胞的增殖和分化与骨骼肌的发育和修复关系密切。

    TNF?α是一种由多种免疫细胞、肿瘤细胞等分泌的细胞因子,它在参与各种免疫应答、抗肿瘤、引起恶病质及内毒素性休克等病理生理过程中发挥重要作用。本实验中,TNF?α组及IGF?I+TNF?α组的CK值均较同一时相点的对照组低(P<0.05),提示TNF?α抑制C2C12成肌细胞的分化,且这种分化抑制未能被IGF?I所拮抗。Guttridge等研究证明TNF?α在INF?γ协调作用下,通过抑制核转录因子?κB(NF?κB),进而抑制骨骼肌细胞肌浆蛋白bHLH转录因子家族的 MyoD蛋白质转录,抑制骨骼肌分化,导致肌肉消耗,当采用NF?κB的拮抗物IκBαSR后MyoD被恢复[9]。

    有研究表明,IGF?I对受TNF?α伤害的C2细胞有微弱的改善蛋白代谢作用,其作用结果可能与影响细胞的分化和细胞凋亡有关[1]。本实验通过IGF?I和TNF?α对体外培养的C2C12成肌细胞在增殖、分化方面的影响，发现TNF?α抑制C2C12成肌细胞的分化未能被IGF?I所拮抗,且IGF?I对C2C12细胞的分化有延迟的作用，笔者认为IGF?I改善TNF?α对C2细胞的蛋白代谢作用可能与其影响细胞凋亡方面关系更为密切，其作用机制仍需进一步实验研究。

【】
  /[1/]陈思曾,林永堃,吕新生. IGF?Ⅰ对TNF?α伤害的鼠骨骼肌C2细胞蛋白代谢的影响/[J/]. 福建医科大学学报, 2003,37(4):361?363.

/[2/]王敏,黄象艳,李霞,等. 胰岛素样生长因子?Ⅰ对臂丛神经损伤后骨骼肌细胞凋亡的影响/[J/]. 矫形外科杂志, 2003,11(19):1371?1373.

/[3/]李银平,黎檀实. 胰岛素样生长因子?Ⅰ对海水浸泡大鼠肺泡?Ⅱ上皮细胞的抗凋亡作用/[J/]. 中华急诊医学杂志, 2004,13(4):248?250.

/[4/]Ye P,D’Ercole A J. Insulin?like growth factor?I protects oligodendrocytes from tumor necrosis factor?alpha?induced injury/[J/]. Endocrinology, 1999,140:3063?3072.

/[5/]徐萍,张克勤,刘超,等. 重组人胰岛素样生长因子?Ⅰ对大鼠成骨细胞增殖、凋亡及Ⅰ型胶原蛋白合成的影响/[J/]. 中国骨质疏松杂志, 2006,12(1):17?21.

/[6/]李小川,吕刚,金明熙,等. 胰岛素样生长因子?Ⅰ抑制人椎间盘细胞凋亡及促进基质代谢的研究/[J/]. 中华实验外科杂志, 2004,21(7):880.

/[7/]秦瑞峰,顾晓明,黄富国. 流式细胞术测定骨骼肌细胞分化中DNA合成及其细胞周期变化/[J/]. 第四军医大学学报, 2000,21(8):921?923.

/[8/]秦瑞峰,顾晓明,张洁. 不同培养条件对骨骼肌细胞增殖及分化的影响/[J/]. 实用口腔医学杂志, 2000,16(1):14?16.

/[9/]Guttridge D C,Mayo M W. NF?κ B?induced loss of MyoD mRNA possible role in muscle decay and cachexia/[J/]. J Sci, 2000,289:2363?2366.