非清髓性骨髓移植诱导同种异基因心脏移植长期免疫耐受的实验研究
【摘要】 目的比较多种不同的预处理方案，筛选一种具有低毒性、能诱导出长期稳定的同种异基因移植免疫耐受的非清髓性预处理方案。方法受体BALB/C(H?2d)小白鼠，供体C57BL/6（H?2b）黑小鼠，建立小鼠耳后心脏移植模型。在心脏移植(HT)前，给予受体腹膜腔内注射抗胸腺细胞血清（ATS）5次、亚致死剂量全身X线照射（TBI）1次、骨髓移植（BMT）等7个不同组合的预处理方案，术后观察移植心脏跳动情况，于骨髓移植后第28 d检测外周血中嵌合体。
结果一实验组(ATS+TBI450 cGy +BMT+HT)采用受体在心脏移植前接受5次腹膜腔内注射ATS、1次TBI（450 cGy）、静注供者骨髓细胞5×107个等处理的非清髓性方案，移植心脏（9/10）存活>100 d；骨髓移植术后第28 d检测外周血，均出现完全异体细胞嵌合状态。结论早期应用ATS与亚致死量TBI有着协同作用；非清髓性预处理方案（ATS+亚致死量TBI(450 cGy)+BMT）既获得了持久、稳定的供者造血干细胞嵌合体，也诱导出同种异基因移植长期特异性免疫耐受。
【关键词】 骨髓移植 心脏移植 基因 移植 同种 合体 免疫耐受
诱导移植免疫耐受是近年来器官移植领域的焦点课题。国外实验证明了造血干细胞嵌合体能够诱导长期、稳定的供者特异性免疫耐受，是目前最有可能应用于临床的免疫耐受诱导方法[1?2]。为探讨一套能够成功地指导临床建立稳定、持久移植耐受的治疗方案，本研究选用成功率高、重复性好、指标客观、稳定的小鼠耳后同种心脏移植模型，通过比较多种不同的预处理方案，旨在筛选出一种具有低毒性、切合临床实际、能诱导出长期稳定的供者特异性移植耐受等优点的围术期预处理方案，为临床应用提供一些理论与实验依据。
1动物与方法
1.1动物7～9周龄雄性BALB/C（H?2d）小鼠作为骨髓移植受者，7～9周龄雄性C57BL/6（H?2b）小鼠作为供者。供、受者体质量20～30 g。出生≤24 h C57BL/6幼鼠作为心脏移植供者。实验动物由福建医科大学动物中心提供[动物合格证号SCXK（沪）2003?0003]。
1.2方法
1.2.1全身X线照射（TBI）按治疗方案所定时间、剂量给受者BALB/C小鼠进行单剂量TBI。X光机（Philips电器公司，Rahway, NJ）200 kV,10 mA，速率84 cGy/min，0.5 mm铜过滤器。
1.2.2抗胸腺细胞血清(ATS)注射ATS购自 Accurate Chemical & Scientific Corporation (NY,USA)。购回后即用BALB/C小鼠红细胞进行脱毒（去掉变应原）处理，分装后置-20 ℃冷藏备用。每只小鼠1次剂量ATS 0.05 mL+生理盐水0.5 mL，腹膜腔内注射。
1.2.3骨髓细胞悬液制备无菌条件下，取供者双侧股骨与胫骨，给予2%胎牛血清PBS溶液冲洗骨髓腔，经60目尼龙网过滤，制备单细胞悬液，调整浓度为1×108 mL-1备用。
1.2.4骨髓细胞移植（bone marrow transplantation,BMT）经尾静脉给予每只受者注射0.5 mL悬液（含有核骨髓细胞5×107个）。
1.2.5小鼠耳后心脏移植将C57BL/6幼鼠置于冰中，2～3 min无菌切开胸骨，取出整个心脏，置于4 ℃生理盐水中，随后将供心移植在受者耳廓皮下。术后第5 d起，在10倍放大镜下观察移植心脏跳动情况。如术后10～12 d仍未出现心脏跳动，则为手术失败，不列入实验结果。以心脏跳动完全停止日定为排斥时间，并隔日进行复查，连续3次结果一致，则确认为排斥反应，并取下移植心脏送病理检查。
1.2.6嵌合体检测主要试剂：抗小鼠单克隆抗体荧光标志物为anti?CD16/CD32(FcrIII/II)，anti?H?2Kb?FITC，anti?H?2Kd?FITC，anti?TCRβ?PE，anti?Gr?1?PE，anti?Mac?1?PE，anti?B220?PE(美国Pharmingen公司)。
在骨髓移植后第28 d采受者眼球后全血，分别
进行T细胞、粒细胞/巨噬细胞、B细胞单克隆抗体荧光染色。所有标本均使用FAC Scan流式细胞仪（Becton Dickinson，MV，CA）检测与分析。
1.2.7组织形态学随机抽取部分被排斥的与长期存活（>100 d）的移植心脏标本，做组织切片及H?E 染色，以验证病理形态学改变与实验观察结果的一致性。
1.3实验分组?预处理治疗方案组所有受者除了进行如下各方案治疗外，不用其他任何免疫抑制剂；所有供者均未作任何特殊治疗。一次性TBI照射，剂量800 cGy 或450 cGy；ATS 为隔天腹膜腔内注射1次，共5次；每只骨髓移植（BMT）细胞数5×107/0.5 mL。分7个治疗方案进行研究：
(1)TBI（800）+BMT+HT
Day-1————Day0—————Day28
TBI（800 cGy）BMT,HT检测嵌合状态
(2）TBI（450）+BMT+HT
Day-1—————Day0—————Day28
TBI（450 cGy）BMT,HT检测嵌合状态
(3）ATS+TBI（450）+BMT+HT
Day -12,-10,-8,-6,-4——Day -1——Day0——Day28
注射ATS（共5次）TBI（450 cGy）BMT,HT检测嵌合状态
(4）ATS+HT
Day -12,-10,-8,-6,-4——Day 0
注射ATS（共5次）HT
(5）ATS+BMT+HT
Day -12,-10,-8,-6,-4—— Day0———Day28
注射ATS（共5次）BMT,HT检测嵌合状态
(6）TBI（450）+HT
Day-1—————Day0
TBI（450 cGy）HT
(7）ATS+TBI（450）+HT
Day -12,-10,-8,-6,-4———Day -1———Day0
注射ATS（共5次）TBI（450 cGy）HT
1.4统计学处理实验数据以实际数据与x±s表
示。多组间比较采用方差分析，两两比较采用Student?Newman?Keuls 检验。
2结果
2.1移植心脏存活时间术前受体给AST（5次）+TBI（450 cGy）+BMT预处理的第3组和术前受体给致死剂量TBI（800 cGy）+BMT的第1组，移植心脏平均存活时间均>100 d，获长期存活，2组之间无统计学意义（P>0.05）。受体术前只给亚致死量TBI、没有ATS（第2组），其移植心脏存活时间（22.1±9.4）d，明显比第1，3组短（P<0.001）。 第4～7组的移植心脏均未获得长期存活，与第3组比较有统计学意义（P<0.001），说明在受体术前非清髓预处理方案中，ATS、TBI（450 cGy）、BMT三者需要同时应用，缺一不可（表1）。
2.2嵌合体在骨髓移植后第28 d，常规检测每只受体小鼠外周血中有核细胞的嵌合体形成情况（表2，图1）。在骨髓移植前，第1组、第2组与预处理组均获得完全异体骨髓细胞嵌合，供体细胞比例均>99%。第5组在骨髓移植前未给予TBI预处理，术后第28 d未能检测出明显的供体细胞嵌合，说明TBI 预处理是骨髓移植术后产生稳定嵌合体的有效手段。
2.3移植心脏组织形态学隔日检查移植心脏跳动情况，如连续3次未见心脏跳动则确认为已被排斥，其病理改变：多灶性坏死，心肌细胞大部分受损，心肌纤维肿胀、断裂，广泛出血，有较多淋巴细胞及单核细胞浸润，纤维组织增生等排斥反应之典型病理表现（图2）。存活的移植心脏(>100 d)未见明显的排斥反应之病理表现，心肌纤维细胞结构完整，未见淋巴细胞浸润，亦未见明显纤维增生(图3)。病理检查结果与肉眼观察结果一致。 表1移植心脏存活时间表2骨髓移植后第28 d受者外周血中供者有核细胞的比例TBI：全身照射（剂量单位：cGy）；BMT:骨髓移植；HT:心脏移植；ATS：抗胸腺细胞血清.
1,2,3,5分别为实验1组[TBI(800 cGy)+BMT+HT]，实验2组[TBI(450 cGy)+BMT+HT]，实验3组[ATS+TBI(450 cGy)+BMT+HT]，实验5组（ATS+BMT+HT）；a:PhyEry?TCR αβ染色 的T细胞；b：PhyEry?Gr?1 & Mac?1染色的粒细胞和巨噬细胞；c：PhyEry?B220染色的B细胞.
3讨论
1980 年代以来，随着环孢菌素A（CsA）等强效免疫抑制剂的应用，器官移植迅猛，移植成功率明显提高。尽管如此，排斥反应在大多数病人身上仍不可避免，尤其是慢性排斥反应以及免疫抑制剂对自体器官与移植物的毒性损害愈显突出，这也是目前同种异基因移植面临的最大障碍。因此寻找一种既能使移植物长期、正常存活，又不损害宿主免疫系统功能的理想方法，即诱导对供?受者双重特异性免疫耐受，才是真正解决排斥、避免药物毒副作用、提高移植物与受者长期存活率的根本途径。
3.1嵌合体形成是诱导长期免疫耐受的重要条件许多学者从动物实验上论证了造血干细胞嵌合体诱导供者特异性免疫耐受的重要性［3?4］。骨髓细胞中含有大量造血干细胞和未成熟树突状细胞，所以输注供体骨髓细胞可以促进嵌合体形成。本实验第1组给予致死剂量TBI(800 cGy),获得了稳定的嵌合状态与移植物的长期免疫耐受。此方案在临床上虽有用于一些重症恶性白血病、淋巴瘤的成功报道，但其毒性大、早期感染发生率高，而且如果供者骨髓细胞输入后未能植活，则将导致受体造血功能衰竭，所以危险性极大，不适用于临床诱导器官移植的免疫耐受[5]。后来，许多学者采用了低毒性、非清髓性亚致死量TBI或低剂量TBI+CD4/CD8 mAb或CTLA4Ig/CD40 LmAb, TLI+ATG等方案，同样获得了稳定、持久的嵌合体和供者特异免疫耐受［6］。本实验第3组采用ATS+亚致死量TBI(450 cGy)+BMT的预处理方案，也获得类似结果。没有给予骨髓移植的对照组4，6，7，其移植心脏在早期（<45 d）均出现排斥反应，说明骨髓移植在诱导供者特异性免疫耐受中起着极其重要的作用。大多数学者认为，这种造血干细胞嵌合体诱导供者特异性免疫耐受的主要机制是中枢性免疫细胞克隆清除，它是通过供者造血干细胞定居在受者胸腺内介导了T细胞的阴性选择，使那些能够识别自身和供者抗原的未成熟Ｔ细胞停止发育、凋亡，即自身反应性和供者反应性Ｔ细胞均被克隆清除，这样只要造血干细胞嵌合体存在，新生的T细胞库都保持着对自身和供者的特异免疫耐受，达到稳定的中枢清除性耐受［7］。因此，骨髓移植或输注造血干细胞产生的嵌合体是维持长期免疫耐受的必要条件，是目前诱导供者特异性免疫耐受最强的途径，也是最有可能应用于临床的免疫耐受诱导方法。
3.2低毒、非清髓性预处理方案在临床上应用的可行性Shapiro等报道，病人在接受肾移植手术的同时，输注同一个供者的骨髓细胞，术后采用常规免疫抑制剂治疗后未能形成稳定、持久的嵌合体，63%病人出现过急性排斥反应［8］。本实验第5组仅给予ATS做预处理，输注同等数量的供者骨髓细胞，28 d后却未能检测出嵌合体，其移植心脏均在术后第1周出现排斥反应。说明得当的预处理方案是骨髓移植存活、供者造血干细胞嵌合体形成与诱导特异性免疫耐受的重要保证。
许多实验资料显示，放射治疗仍然是目前用于灭活受体成熟T细胞、提高供者造血干细胞植活、形成稳定嵌合体的最有效、实惠、方便的主要手段之一。Millan等报道4例肾移植患者术后给予TLI，ATG，造血干细胞移植（HPCT）与CsA、强的松联合治疗，1例术后1年已完全停用免疫抑制剂，2例正在减少药量中，这是近年来应用诱导免疫耐受方案获得术后最早完全停药的成功病例[9]。但TLI需要反复多次照射，疗程长，所以本实验改用一次性TBI治疗。本实验第2，3组，均采用了非清髓性、亚致死量TBI做预处理，骨髓移植28 d后均获得完全异体细胞嵌合,说明亚致死量TBI可以帮助骨髓移植产生持久、稳定的供者造血干细胞嵌合体。至于第2组在早期移植心脏出现排斥反应、第3组加用ATS却获得了移植物长期免疫耐受的结果，笔者认为早期应用ATS,与亚致死量TBI有着协同作用，对预防移植早期出现排斥反应有着重要作用，对此正进一步研究中。
笔者认为，本实验各治疗方案中，第3组预处理方案（ATS+亚致死量TBI+BMT）效果最佳，既获得了持久、稳定的供者造血干细胞嵌合体，也诱导出长期供体特异性免疫耐受，是一种低毒、安全、非清髓性预处理方案，而且该方案中治疗时间安排比较符合临床实际操作，具有重要的实际应用价值与指导意义。
【】
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