HIF-1α、2α和Survivin蛋白在食管鳞癌中的表达及临床意义

              作者：马臻奇 范钟麟 王学红 

【摘要】  目的 探讨缺氧诱导因子（HIF-1α、HIF-2α）和生存素蛋白（survivin）在食管正常粘膜、食管炎、食管鳞癌（ESCC）组织中的表达，并测定食管正常粘膜、食管炎、食管鳞癌组织中的微血管密度，初步分析它们与食管鳞癌生物学行为之间的关系。方法 采用免疫组织化学(SP)方法分别检测65例食管正常粘膜、食管炎、食管鳞癌组织中HIF-1α、HIF-2α和survivin的表达，同时测定微血管密度(MVD)计数。结果 (1) HIF-1α、HIF-2α和survivin在食管正常粘膜组织中不表达，食管炎组织中低表达，食管鳞癌中高表达，在食管不同组织分型中三者的表达比较具有显著性差异(P<0.01)。随正常粘膜-炎症-癌的次序MVD计数呈逐渐升高趋势。(2)Survivin在食管鳞癌组织中表达越强，组织分化程度越低(P<0.01)、TNM分期越晚(P<0.01)、淋巴结转移率越高(P<0.01)；HIF-1α和HIF-2α在食管鳞癌组织中表达越强，淋巴结转移率越高(P<0.01)，组织分化程度越低(P<0.05)，两者与组织分化程度、TNM分期呈负相关。(3)食管鳞癌中HIF-1α、HIF-2α表达与survivin表达呈正相关(P<0.01), 三者表达与MVD呈正相关(P<0.01)。结论 (1) HIF-1α、HIF-2α和survivin表达对食管鳞癌的发生、起正性协同作用；(2)检测食管鳞癌组织中survivin的表达对判断肿瘤的发生、发展具有重要意义。survivin可望成为诊断和食管鳞癌的新靶点。 

【关键词】  食管鳞癌 缺氧诱导因子 生存素蛋白 免疫组织化学

    Abstract  Objective   To identify MVD and illustrate the significance of expression of HIF-1α、HIF-2α and survivin in normal mucosa of esophagitis and esophageal squamous cell cancer, and its relationship to the biological behavior of esophageal squamous cell cancer. Methods  HIF-1α、HIF-2α and  survivin  in 65 specimens resection from patients with normal mucosa、esophagitis and esophageal squamous cell cancer were investigated by IHC S-P staining method and identify the MVD as well. Results (1)The expression of HIF-1α、HIF-2α and survivin in  normal mucosa was non-expression, low in esophagitis ,high in esophageal squamous cell cancer , the expression of esophageal squamous cell cancer was significantly higher than its expression in normal mucosa and esophagitis(P<0.01). MVD was more higher as the  progression of normal mucosa, esophagitis and esophageal squamous cell cancer. (2)Expression of  survivin in esophageal squamous cell cancer was inversely correlated with the histological differentiation of tumor, lymph node metastasis and TNM stage(P<0.01). Expression of HIF-1α、HIF-2α was positively related with lymph node metastasis(P<0.01) and histological differentiation of tumor(P<0.05),inversely correlated with TNM stage(P<0.01). (3)Expression of HIF-1α、HIF-2α and survivin were positively related with each other(P<0.01) and the MVD(P<0.01). Conclusion (1)HIF-1α、HIF-2α and survivin were collaborative in progression of esophageal squamous cell cancer. (2) The detection of survivin maybe show important clinical value to evaluate the occurrence, progression and prognosis of esophageal squamous cell cancer. Hopefully, survivin can be a new target for genetic diagnosis and therapy.

    Key words  Esophageal squamous cell cancer   Hypoxia inducible factor  Survivin    Immunohistochemistry

    在实体瘤的恶性增殖过程中普遍存在缺血缺氧的现象，肿瘤细胞的缺氧适应主要由HIF介导，肿瘤内缺氧可导致HIF过表达，并涉及肿瘤细胞的代谢适应、凋亡抵抗、血管生成和侵袭与转移相关的基因表达［1］，其中研究较多的是HIF-1α，有关HIF-2α在食管鳞癌组织中表达的研究较少。生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白家族的新成员，在胚胎组织高表达，而在正常成体组织，除了胎盘和胸腺之外，几乎检测不到，具有高度特异性［2］，在大多数肿瘤组织中发现有survivin的异常高表达，这一特点为肿瘤诊断及治疗提供了新的靶点。为此我们通过免疫组织化学(SP)方法，检测了HIF-1α、HIF-2α和survivin在食管鳞癌中的表达情况，并初步研究分析了它们与食管鳞癌生物学行为之间的关系。

    1  材料与方法

    1.1  临床资料

    随机选取青海大学附属胃镜检查及手术确诊的食管鳞癌标本65例，其中男性41例，女性24例，年龄35～78岁，平均年龄56.5±6.9岁。65例食管鳞癌标本TNM分期:I期4例；ⅡA期40例，ⅡB期11例；Ⅲ期10例。高分化癌19例，中分化癌25例，低分化癌21例。全部病例术前未经化疗、放疗及生物治疗。标本均在10％中性福尔马林液中固定，每例以常规方法制切片2张，厚度为4μm。另外分别选取65例食管炎症组织和正常粘膜组织作对照。观察组和对照组在性别及年龄上无统计学差异(P>0.05)。

    1.2  主要试剂

    兔抗人多克隆survivin即用型工作液、HIF-1α和HIF-2α鼠抗人单克隆抗体浓缩型工作液、即用型ElivisionTM plus试剂盒（鼠/兔）、DAB显色试剂盒，均购自福州迈新生物技术有限公司。

    1.3  免疫组化检测方法

    石蜡切片脱蜡水化后均先行高温高压抗原修复，其余步骤按ElivisionTM plus试剂盒说明书操作。以PBS液代替一抗作阴性对照，用已知阳性的组织作阳性对照。

    1.4  结果判断方法

    HIF-1α、HIF-2α表达于细胞核，出现棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性，按阳性细胞百分数分组：每张切片随机取5个高倍镜视野(×400)，计数200个细胞并阳性细胞所占百分数。阳性细胞数<1%者为阴性，1%～10%者为弱阳性，11%～50%者为阳性，>50%者为强阳性，弱阳性至强阳性表达视为阳性表达。Survivin表达于细胞质，出现棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性，按染色深浅分组：阴性(-)：无染色；弱阳性(+)：浅染色；阳性(++)：中度染色；强阳性(+++)：强染色。分组在病理科医生不了解病例临床预后情况下进行。

    MVD计数：参照Weidner等报道的方法, 每张切片随机取5个高倍镜视野(×400)，记录5个视野内的微血管数, 取其平均值作为该病例的MVD值。

    1.5  统计学分析方法

    采用SPSS12.0统计软件包进行统计分析。计数资料以百分率表达，显著性检验采用χ2检验；计量资料以(x±S)表达，显著性检验采用方差分析、t检验；做秩相关分析。

    2  结果

    2.1  食管不同组织分型中HIF-1α、HIF-2α和survivin的表达情况

    HIF-1α、HIF-2α和survivin在食管正常粘膜组织中不表达，在食管炎组织中低表达，在食管鳞癌中高表达。MVD计数随着正常粘膜-炎症-癌次序呈逐渐升高趋势，见表1。表1食管不同组织分型的比 注：*与正常粘膜比较P<0.01；★与食管炎比较P<0.01.

    2.2  食管鳞癌中HIF-1α、HIF-2α和survivin的表达情况

    淋巴结转移组HIF-1α、HIF-2α和Survivin阳性率分别为92.31%、100%和92.31%，与淋巴结无转移组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，MVD计数（30.36±2.78）与淋巴结无转移组比较有显著性差异(P<0.01)；组织分化程度低组HIF-1α、HIF-2α和Survivin阳性率分别为95.24%、100%和100%，三者与组织分化程度高、中组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，MVD计数(30.52±2.89)与组织分化程度高、中组比较有显著性差异(P<0.01)；TNM分期ⅡB、Ⅲ组HIF-1α、HIF-2α和Survivin阳性率分别为90.48%、95.24%和90.48%，其中survivin与TNM分期Ⅰ、ⅡA组比较有显著性差异(P<0.05)，而HIF-1α和HIF-2α与TNM分期Ⅰ、ⅡA组比较没有显著性差异（P>0.05），MVD计数(30.58±2.67)与TNM分期Ⅰ、ⅡA组比较有显著性差异(P<0.01)，见表2。表2 65例食管癌各因素比较 注：  *与淋巴结无转移比较，P<0.05；**，P<0.01；▲与分化程度高、中比较P<0.05，▲▲与分化程度高、中比较P<0.01；★，与TNM分期Ⅰ、ⅡA比较，P<0.05，★★P<0.01.

　　2.3  食管鳞癌中HIF-1α、HIF-2α和survivin表达间的相关性

    HIF-1α、HIF-2α与survivin表达均呈正相关(P<0.01)，随着HIF-1α、HIF-2α和survivin表达强度的升高，MVD呈升高趋势，三者与MVD计数均呈正相关关系(P<0.01)，见表3。 表3 食管癌中HIF-1α、HIF-2α和Survivin表达的相关性

    3  讨论

    3.1  HIF-1α、HIF-2α对食管鳞癌生物学行为的影响

    HIF是近年来发现的广泛存在于哺乳动物细胞中介导低氧适应的一种异源二聚体核转录因子，HIF-1含有α亚基(HIF-1α)和β亚基(HIF-1β)。HIF-2与HIF-1在结构上极其相似，也是由诱导表达的α亚单位和持续表达的β亚单位组成异源二聚体结构。两者的生物活性由α亚基决定，表达严格地受细胞氧浓度的调节。在缺氧状态下，HIF-1和HIF-2通过启动下游靶基因（如红细胞生成素、血管内皮生长因子、葡萄糖载体-1、糖酵解酶等）的表达对肿瘤的血管生成、能量代谢、激素代谢等方面产生重要作用［3,6］，促使恶性肿瘤增殖、浸润和转移。肿瘤适应缺氧的重要途径之一是新生血管的形成［7］, 而肿瘤新生血管形成与实体瘤的发生、侵袭和转移密切相关，并影响大部分恶性肿瘤的预后。许多研究已表明，HIF-1α和HIF-2α是VEGF关键的激活因子［8,11］。最近有研究表明HIF-1α和HIF-2α可能存在不同的转录调控功能和基因结合位点［12,13］，HIF-1α表达随缺氧时间的延长呈进行性下降, 而HIF-2α表达却呈进行性升高。Krieg等［１４］发现无论在常氧还是低氧条件下，HIF-2α较HIF-1α对VEGF mRNA具有更强的激活能力，并且HIF-2α在转录激活VEGF mRNA的特异性上较HIF-1α更强。Raval等［１５］认为HIF-2α对肿瘤生长起促进作用，HIF-1α对肿瘤生长起抑制作用。

    本研究观察到，HIF-1α和HIF-2α在食管鳞癌中高表达，在食管炎组织中低表达，在食管正常组织中的阳性表达率均为0。在食管不同组织分型中三者的表达比较具有显著性差异(P<0.01)。同时发现MVD计数随着正常粘膜-炎症-癌次序呈逐渐升高趋势，三者的MVD计数比较也有显著性差异(P<0.01)。本研究显示，HIF-1α和HIF-2α在食管鳞癌组织中表达越强，淋巴结转移率越高(P<0.01)，组织分化程度越低(P<0.05或P<0.01)，提示HIF-1α和HIF-2α过表达可能在食管鳞癌的进展转移过程中起重要作用, 是食管鳞癌预后不良的一个标志, 这与罗明华等［21］的研究结果相同。我们认为通过降低HIF-1α和HIF-2α的活性来抑制VEGF表达, 可能会成为对食管鳞癌行抗血管生成的一条新途径。

    3.2  Survivin对食管鳞癌生物学行为的影响

    Survivin是凋亡蛋白抑制因子(IAP)家族的新成员，基因定位于染色体17q25，由编码142个氨基酸组成的分子量为16.5kD的蛋白质。在人类胚胎发育组织和绝大多数恶性肿瘤组织中均有survivin表达，其通过特异性地与caspase-3和caspase-7结合，抑制有活性的半胱天冬蛋白酶形成，从而发挥强大的抗凋亡作用［17，18］。有研究表明 ［19，23］，survivin在食管癌组织中表达上调时，survivin阳性表达患者的癌细胞血管侵犯发生率明显高于阴性表达患者，survivin在肿瘤细胞中表达越强，癌细胞的生存能力和肿瘤的恶性程度越高，癌细胞更容易侵袭周围组织而发生转移，患者存活率明显降低。

    本研究观察到，survivin在食管鳞癌组织中高表达，在食管炎组织中低表达，在食管正常组织中的阳性表达率为0，三者比较有显著性差异(P<0.01)。本组研究显示，survivin在食管鳞癌组织中表达越强，组织分化程度越低(P<0.01)、TNM分期越晚(P<0.01)、淋巴结转移率越高(P<0.01)，说明其与食管鳞癌生物学恶性行为有明显相关性(P<0.01)，提示survivin在食管鳞癌细胞的凋亡、增殖和转移过程中起重要作用。我们认为检测食管鳞癌组织中survivin的表达对判断肿瘤的发生、情况以及解释其生物学行为方面具有重要意义，survivin可望成为诊断和治疗食管鳞癌的新靶点。

    3.3  食管鳞癌组织中survivin与HIF-1α、HIF-2α的关系

    有研究证实［24，25］，在肿瘤微缺氧环境中survivin表达显著增加，HIF-1α可通过直接诱导survivin表达或间接影响其活性而增强其抗凋亡作用。本研究结果显示，食管鳞癌中随着HIF-1α、HIF-2α阳性细胞百分数升高，其survivin表达阳性率也相应增强，HIF与survivin表达呈正相关(P<0.01),说明HIF与食管鳞癌细胞凋亡抑制关系密切；食管鳞癌中HIF-1α、HIF-2α和survivin表达与MVD计数呈正相关(P<0.01)，说明三者与食管鳞癌血管生成关系密切。我们认为HIF-1α、HIF-2α和survivin在食管鳞癌发生发展中可能发挥了正性协同作用，它们之间的分子生物学关系尚待进一步研究阐明。

【】
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