部分肝切除小鼠肝再生的研究

             作者：俞炯，姚一帆，吕建新，曹红翠，陈瑜 

【摘要】  目的: 通过部分肝切除建立小鼠肝再生动物模型，研究肝脏再生过程中形态和血清学变化趋势，为研究肝再生调控机制奠定实验基础。方法:采用50％肝切除方法建立C57/BL6小鼠肝再生模型；分别于手术后第1、第5、第9、第13、第21和第36天，摘眼球法取血，分离血清后检测ALT、AST、AFP和ALB，并进行C-反应蛋白（CRP）、肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子-α（TGF-α）等细胞因子的检测。并取肝脏组织进行苏木素-伊红(HE)染色，研究肝再生过程中形态学改变。结果:光镜下可见肝切除后肝细胞核分裂极其活跃；ALB分泌降低，后逐渐升高至正常值；ALT、AST先升高后逐渐下降，但一直高于正常值；AFP持续为阴性；CRP在术后5 d内迅速升高，之后有所下降；HGF在术后持续保持较高水平，且在死亡小鼠中也有测到高值的HGF；EGF与TGF-α都升高。结论:多种细胞因子参与肝再生调控，在肝再生过程中，能够继续维持白蛋白合成、有毒物质降解等肝细胞特异性功能而保持机体的稳定。

【关键词】  肝再生；小鼠；血清学；细胞因子

    Abstract:  Objective: To study the changes in morphology and serum during the process of liver regeneration，　which may lay the experimental foundation of the research of the accommodation mechanism of liver regeneration. Methods: Establish a C57/BL6 mice model of liver regeneration by 50% hepatectomy. After surgery，take the blood samples of mice on 1st，5th，9th，13th，21th，36th，days，measure the value of ALT，AST，AFP，ALB，and detect the cytokines of C-reactive protein (CRP)，liver cell growth factor (HGF)， epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor-α(TGF-α). And then observe the morphological changes of liver cells during the regeneration process by Hematoxylin and Eosin Staining. Results: The multiplicative division of nucleus of liver cells was extremely active under the light microscopy after the surgery. The production of Albumin (ALB) was depressed after the surgery， and increased gradually to normal level on the 36th day. Alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were increased rapidly just after the surgery， and then decreased gradually to the normal level. AFP was all negative during the research time. The degree of the creactive protein(CRP) extremely rose in the first five days， and then it decreased a little， but still above the normal value. Hepatocyte growth factor (HGF) sustained increase，which could also be detected in the died mice. Epidermal growth factor (HGF) and Transforming growth factor-α(TGF-α) were both increased. Conclusion:  A variety of cytokines are involved in the liver regeneration accommodation， In the regeneration process，liver can still remain some liver-specific functions，such as albumin synthesis，toxin degradation and so on，thereby can maintain the stability of the body.

    Key words:  liver regeneration；mouse；serology；cytokine

    肝细胞是稳定细胞，正常成人及成年动物肝脏的肝小叶内都是分化成熟的肝细胞，很少见到核分裂。然而在肝脏遭受损伤时，这种低分化状态可以发生改变，手术切除或毒性损伤可以引起快速广泛的肝细胞增殖。肝再生反应是一个极其复杂、多因素参与调控的过程，尽管对肝再生进行了大量的分子生物学研究，包括激素、生长因子和细胞因子，以及相关基因，但是肝再生的分子机制，尤其是肝再生过程的机制仍不清楚。

    本实验以C57/BL6小鼠为实验对象，通过手术切除小鼠50%肝脏建立肝再生模型，并连续进行血清学、形态学和细胞因子的检测，为揭示小鼠肝损伤再生过程奠定实验基础。

    1  材料和方法

    1.1  材料  SPF级C57/BL6雄性小鼠49只，购自浙江省实验动物中心；ALT、AST、ALB检测试剂购自上海申索佑福公司；AFP检测试剂购自Abbott公司；CRP、HGF购自R&D公司；EGF、TGF-a购自武汉博士德公司。

    1.2  方法

    1.2.1  分组：采用随机数字表法将C57/BL6雄性小鼠49只，平均体重20 g，分为正常对照组(7只)和模型组(42只)。手术前将空白对照组2只小鼠，摘除眼球眼眶取血，分离血清后-80 ℃保存。打开腹腔，摘取肝左叶，切取肝组织3块保存。模型组42只小鼠麻醉后以肝胆管为界行1/2肝脏切除术。在术后第1、第5、第9、第13、第21和第36天随机取7只小鼠，摘眼球取血，分离血清，-80 ℃保存，并取肝组织3块保存。

    1.2.2  检测指标：取保存肝脏组织用体积分数为4% 的多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片备检。采用生化自动分析仪测定小鼠血清ALT、AST、ALB 值；用免疫法测定小鼠血清AFP值。ELISA法检测小鼠血清CRP、HGF、EGF、TGF-α。

    2  结果

    2.1  ALT、AST、ALB、AFP及细胞因子的动态变化趋势  ALB于第1天表达最低，然后慢慢升高到21 d达到正常并一直维持在较高水平；ALT、AST在迅速升高后，随着时间的延长逐渐下降并接近正常水平；CRP在前5 d快速升高，然后开始下降，但是始终高于正常；HGF在手术后36 d中持续升高，且升高幅度明显，在模型组中死亡小鼠测得的HGF值接近该组存活小鼠第36天HGF值；EGF在术后1 d内升高了1倍，后有所下降，但始终高于正常值。TGF-α在术后1 d内升高接近5倍，后有所下降。肝切除术前后AFP表达表达一直为阴性（见表1）。

    2.2  光镜观察  正常对照组肝组织切片苏木素- 伊红(HE) 染色显示，正常对照组肝小叶结构清晰， 肝细胞索呈放射状排列，肝血窦清晰（见图1）；模型组术后5 d，弥漫性肝细胞浊肿，肝细胞核明显增大，可见双核及有丝分裂期肝细胞，肝索结构紊乱，小叶结构消失（见图2）；术后13 d，肝细胞轻度浊肿，间质炎性细胞浸润（见图3）；至第36天，形态恢复正常肝组织形态（见图4）。

    3  讨论

    ALT、AST为氨基酸代谢中的重要酶，存在于肝细胞内，肝细胞受损伤时，细胞膜结构破坏，通透性改变，即可从细胞内逸出细胞外而进入血循环中。此时血清ALT、AST 较正常增高，故血清ALT、AST 测定是反映肝损伤的灵敏指标。ALB可反映肝脏合成蛋白质的功能。肝细胞损伤，则肝细胞内质网上结合的核糖体合成白蛋白功能发生障碍，故在肝部分切除后ALB血清浓度下降，然而随着肝脏的再生恢复，血清中的白蛋白含量升高。

    AFP是一种含糖蛋白，分子量约70 kD，在胎儿期内由卵黄囊和肝脏产生，出生后AFP迅速降至正常。在本实验中所有时间点所测值都小于检测线。说明AFP并不能反应肝部分切除时肝细胞增殖情况，和Nagasue等[1]的研究一致。

    多种细胞因子参与了肝再生的调控，CRP是一种能与肺炎球菌C多糖体反应形成复合物的急性时相反应蛋白[2]。CRP作为急性时相蛋白在各种急性炎症、组织损伤、心肌梗死、手术创伤、放射性损伤等疾病发作后数小时迅速升高，并有成倍增长之势。病变好转时，又迅速降至正常[3]。

    HGF是一种多功能因子，参与胚胎器官生成、肿瘤细胞的扩散和迁移、组织再生和多种细胞的修复过程。它以旁分泌和内分泌的方式，通过与肝细胞膜上特异性受体(癌基因c-met产物)结合而发挥作用[4]。实验中，HGF值持续升高，且在死亡小鼠中也能测到高水平的HGF值，推断术后HGF浓度增高可能是全身反应之一，血清中增高的HGF来自其他器官，而不是来自肝脏。HGF可能是严重肝功能不全的征象而不是肝再生活跃的标志。

    TGF-α和EGF有35%的同源性，通过同一受体结合并激活表皮生长因子受体（EGFR）的酪氨酸激酶自身和蛋白质底物磷酸化，进而激活蛋白激酶和依赖的蛋白酶，引起细胞的分裂增殖，促进肝脏再生[5]。本实验显示在肝再生过程中两者持续增高。

    肝再生机制至今不明，通过小鼠血清学和细胞因子的测定，CRP、HGF、EGF和TGF-α等多种细胞因子参与了肝再生调控，在肝再生过程中，能够继续维持白蛋白合成、毒物降解等肝细胞特异性功能而保持机体的稳定。

【】
  [1] Nagasue NF,Inokuchi K,Kobayashi M,et al.Serum alpha? fetoprotein in patients following partial hepatectomy[J].DigDis Sci,1980,25(4):243-247.

[2] Galun E,Axelrod JH. The role of cytokines in liver failure andregeneration: potential new molecular therapies [J].Biochim Biophys Acta,2002,1592(3):345-358.

[3] Pepys MB,Hirschfield GM.C-reactive protein:a critical up-date[J].J Clin Invest,2003,111(12):1805-1812.

[4] Lindroos PM,Zarnegar R,Michalopoulos GK.Hepatocytegrowth factor (hepatopoietin A) rapidly increases in plasmabefore DNA synthesis and liver regeneration stimulated bypartial hepatectomy and carbon tetrachloride administration.[J].Hepatology,1991,13(4):743-750.

[5] Gabriele Sass,Sonja Heinlein, Andrea Agli, et al.Cytokine ex-pression in three mouse models of experimental hepatitis[J].Cytokine,2002,(3):115-120.