成肌纤维细胞在哮喘气道重塑中的作用及地塞米松对其的影响
作者：林洁，戴元荣，赵初环，徐永安，吴成云，颜孙舜
【摘要】 目的: 探讨成肌纤维细胞(MF)在哮喘气道重塑中的作用并观察地塞米松对其的影响。方法: SD大鼠30只，随机分为哮喘组(A组)、生理盐水对照组(C组)和地塞米松组（D组），每组10只。利用卵白蛋白(OVA)/Al(OH)3致敏与OVA雾化吸入激发建立大鼠哮喘模型。免疫组化测定肺组织中支气管上皮下成肌纤维细胞的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达含量，并使用图像分析技术进行积分光密度（IOD）定量分析测定。ELISA法测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中TGF-β1 和IFN-γ的浓度。结果: ①定量分析测定的IOD值显示A组支气管上皮下MF的α-SMA表达量较C组显著增加（P＜0.01），D组表达量较A组减少（P＜0.05）。②ELISA法测定结果：A组BALF中TGF-β1浓度较C组显著升高（P＜0.01），D组较A组浓度降低（P＜0.01），但仍高于C组（P＜0.05）。A组BALF中IFN-γ浓度较C组显著降低（P＜0.01），D组较A组浓度高（P＜0.01），但仍低于C组（P＜0.05）。结论: MF在气道重塑形成中起重要作用。地塞米松可能通过减少TGF-β1，增加IFN-γ的产生，抑制MF增殖和表达，起到抗哮喘气道重塑的作用。
【关键词】 哮喘；气道重塑；成肌纤维细胞；糖皮质激素；大鼠
Abstract: Objective: To explore the effect of myofibroblast(MF) on asthmatic airway remodeling and the effect of dexamethasone on it. Methods: In the experiment，thirty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into the asthma group（group A），the sodium chloride control group (group C) and the dexamethasone group（group D）. There were ten rats in each group. The rats were sensitized with ovalbumin and Al(OH)3 before repeatedly exposed to aerosolized ovalbumin. The α-smooth muscle actin（α-SMA） expressions of MF of bronchial subepithelium in lung tissue were assessed with immunohistochemistry. By image analysis technique，their integral optical density（IOD）were quantitatively analysed. The concentra-tion of TGF-β1 and IFN-γ in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）was measured by ELISA. Results: ①Compared with group C，the IOD value by quantitative analysis showed that the expression of MF's α-SMA in bronchial subepithelium in group A was significantly increased（P＜0.01），and the expression in group D was significantly decreased compared with group A（P <0.05）. ②The results of ELISA: The concentration of TGF-β1 in BALF in group A was higher than that in group C （P＜0.01），and the concentration of TGF-β1 in BALF in group D was lower than that in group A （P <0.01）， but still higher than that in group C （P <0.05）. The concentration of IFN-γ in BALF in group A was lower than that in group C（P＜0.01），and the concentration of IFN-γ in BALF in group D was higher than that in group A(P <0.01)，but still lower than that in group C（P <0.05）. Conclusion: MF plays an important role in the course of airway remodeling. Dexamethasone may decrease the concentration of TGF-β1 and increase the concentration of IFN-γ， then inhibit proliferation and expression of MF. So Dexamethasone may be an effective drug to inhibit asthmatic airway remodeling.
Key words: asthma；airway remodeling；myofibroblast；glucocorticoids；rat
大量研究证明，支气管哮喘不仅存在着气道炎症，而且还发生气道结构的改变，即气道重塑(airway remodeling)。气道重塑并非只发生在重症哮喘或哮喘病程的晚期，有证据表明在儿童哮喘的早期就存在气道重塑[1，2]。近几年来，有关哮喘气道重塑的研究在国内外已成为一个热点课题。但到目前为止，其发生机制仍未完全阐明，也缺乏有效的防治措施。本研究建立大鼠哮喘模型，探讨成肌纤维细胞(myofibroblast, MF)在哮喘气道重塑中的作用并观察地塞米松对其的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠30只，体重150～200 g，SCXK(浙)2005-0019。
1.2 主要试剂和设备 卵白蛋白(OVA)，购自美国Sigma公司；Al(OH)3，自行配制；免疫组化一抗：小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化二抗：羊抗鼠即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒，购自福州迈新生物技术开发有限公司；大鼠TGF-β1试剂盒(ELISA)、大鼠IFN-γ试剂盒(ELISA)均为RapidBio Lab. USA产品。
自动洗板机(Biol-Tek ElX 50)，自动酶标仪(Bio-TEK ELX 808IU)，OLYMPUS光学显微镜，图像采集系统(LOGENE-I YG 免疫荧光图象处理2006版V1.2.10)，图像分析软件Image-Pro Plus 5.1。
1.3 动物分组和模型的制备 将30只大鼠随机分为3组，每组10只：①哮喘组（A组）；②生理盐水对照组（C组）；③地塞米松治疗组（D组）。动物模型制备李昌崇等[3]的方法：第1天和第8天A、D组大鼠腹腔内注射OVA/Al(OH)3混合液1 ml(内含OVA 1 mg和Al(OH)3100 mg)致敏；C组腹腔内注射等量生理盐水。第15天开始A、D组雾化吸入含1% OVA的生理盐水8 ml激发哮喘，每天一次，每次30 min，共6周；C组用生理盐水8 ml雾化吸入，每天一次，每次30 min，共6周。每次激发前30 min，D组首先给予地塞米松0.5 mg/kg灌胃，A组和C组用等量生理盐水代替，灌胃时间与D组相同。
1.4 BALF和肺组织标本留取及光镜标本制作 各组在末次激发后24 h，按400 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液，固定于操作台，分离肺组织，经气管行右肺灌洗，用10 ml生理盐水分次注入，并用手指轻轻按摩肺组织，约30 s后回收BALF，回收率高于80%，离心后取上清液分装保存于-80 ℃备用。左肺予4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋制片，切片厚5μm。
1.5 肺组织HE染色 按常规HE染色步骤进行。
1.6 免疫组化法检测α-SMA的表达 以磷酸盐缓冲液PBS代替一抗作为空白对照，按试剂盒说明书进行染色。肺组织标本切片在光学显微镜放大100～400倍下找到完整的中小支气管横断面，每张切片选取3支，MF以支气管上皮下α-SMA染色阳性的细胞，α-SMA表达阳性的细胞浆经DAB染色成棕黄色。采用图像采集系统获取图像后再以Image-pro plus图像分析软件测量分析，分别测定3支支气管上皮下积分光密度（integral optical density，IOD），计算其平均值代表支气管上皮下α-SMA表达相对含量，也代表MF相对数量。
1.7 支气管壁厚度、内管壁厚度及支气管平滑肌厚度测定 参考[4]关于气道各层的定义，肺组织标本切片在光学显微镜放大100～400倍下找到完整的中小支气管横断面，每张切片选取3支（与上述检测α-SMA的部位相同），采用图像采集系统获取图像后再以医学图像分析软件Image-pro plus测量分析，测定支气管基底膜周径（Pbm）、总管壁面积(Wat)、内管壁面积(Wai)、支气管平滑肌面积（Wam），将测得的后三个值除以Pbm，分别代表总管壁厚度(Wat/Pbm)、内管壁厚度(Wai/Pbm)、平滑肌层厚度(Wam/Pbm)。每标本各取3个支气管横断面测量，取其平均值。
1.8 双抗夹心ELISA法测BALF中TGF-β1和IFN-γ的浓度 具体操作过程按试剂盒说明书进行。
1.9 统计学处理方法 多组间比较采用单因素方差分析，用Homogeneity of Variances Test进行方差齐性检验。多组间两两比较，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Tamhane’s T2检验，两变量的相关分析用Pearson直线相关分析法。
2 结果
2.1 各组大鼠体征比较 A组大鼠经致敏和激发两阶段后，出现了不同程度的烦躁不安、呼吸急促、喘息、腹肌抽搐和大小便失禁等症状，严重者呼吸减慢、节律不规则、反应迟钝、行动迟缓。C组无上述表现。D组上述表现则较A组明显减轻。
2.2 各组大鼠肺组织大体改变及组织病改变比较
2.2.1 肺组织大体改变：A组大鼠肺组织出现轻度不均匀性膨胀、质地偏硬，表面有不规则的暗红充血区。C组无上述表现。D组上述表现较A组减轻。
2.2.2 肺组织病改变：A组HE染色切片显示肺内支气管管壁、支气管及血管周围大量的炎性细胞浸润(包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞)，黏液腺增生，黏膜皱折增多，气道上皮多处断裂和上皮细胞的脱落，管腔内可见炎性细胞渗出和分泌物，支气管内可见黏液栓，支气管平滑肌层明显增厚，管腔狭窄。D组上述表现减轻。C组未见上述现象。
2.3 图像分析软件分析测量支气管基底膜周径和管壁各层厚度 见表1。
2.4 各组大鼠肺组织α-SMA的表达 采用上述测量支气管基底膜周径和管壁各层厚度的支气管，予以测定支气管上皮下IOD值。见表2。
2.5 各组大鼠BALF中TGF-β1和IFN-γ浓度 见表3。
2.6 相关性分析 支气管上皮下成肌纤维细胞α-SMA表达的IOD值与内管壁厚度呈正相关（r =0.921，P＜0.01，n=30)，与平滑肌层厚度也呈正相关（r =0.662，P＜0.01，n=30)。BALF中TGF-β1浓度与支气管上皮下成肌纤维细胞α-SMA表达的IOD值呈正相关（r =0.798，P＜0.01，n=29)，而BALF中IFN-γ浓度与其呈负相关（r =-0.716，P＜0.01，n=29)。支气管平滑肌厚度与BALF中TGF-β1浓度呈正相关（r =0.790，P＜0.01，n=29)，而与BALF中IFN-γ浓度呈负相关（r =-0.872，P＜0.01，n=29)。
3 讨论
气道重塑的基本形态学表现为气道壁的增厚和气管腔的狭窄，组织学表现为气道上皮破坏，杯状细胞化生及增生，黏膜下MF增殖并过度合成和分泌细胞外基质而导致基底膜增厚，气道平滑肌细胞增生、肥厚，黏膜内微血管形成等。
气道重塑的发生机制尚未明确，近来研究发现哮喘患者支气管上皮下存在MF，并且数量较正常人增多[5]。有研究者发现[6， 7]支气管基底膜的增厚和上皮下胶原的增多与上皮下MF数量相关。MF超微结构特征介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间，大多数情况下以表达α-SMA为主，这也是与成纤维细胞的不同之处。MF在气道黏膜下增殖和积聚使气道壁增厚。MF本身具有收缩性，使管腔更加狭窄，并且MF产生的胶原纤维、弹性纤维和网状纤维等沉积于基底膜，限制管腔扩张。故MF和气道重塑关系密切。
本实验经致敏和激发两阶段，根据大鼠的体征、肺组织病理改变，其总管壁厚度、内管壁厚度、平滑肌层厚度较对照组有显著增厚，提示哮喘大鼠气道重塑模型建立成功。本实验通过测定上皮下表达α-SMA的MF，发现哮喘组MF相对量较对照组显著增加，并且其相对量与支气管的内管壁厚度和平滑肌厚度成正相关（r =0.921，P＜0.01，n=30和r =0.662，P＜0.01，n=30)，特别是与内管壁厚度相关更密切。可能是随着MF增多，产生的胶原纤维、弹性纤维和网状纤维增多，沉积于上皮下，使内管壁上皮下纤维化和增厚。故MF数量和内管壁厚度有更明显的正相关。
MF数目的增多，其机制可能是上皮受损以后，经多种细胞因子的作用，通过某种信号转导机制，促进成纤维细胞转化为MF，目前研究较多的细胞因子为TGF-β1 [8，9]。本实验发现哮喘组BALF中TGF-β1浓度较生理盐水对照组显著升高，并且与上皮下表达α-SMA的MF相对量成正相关，与支气管平滑肌厚度亦成正相关。这提示随着TGF-β1浓度的升高MF表达增多，导致并加重了气道重塑。另有研究表明，INF-γ能抑制肺成纤维细胞增生和转化以及肺泡细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成[10，11]。本实验发现哮喘组BALF中INF-γ浓度较生理盐水对照组显著减低，并且与上皮下表达α-SMA的MF相对量成负相关，与支气管平滑肌厚度亦成负相关。这提示INF-γ能抑制MF的表达，抑制了气道重塑。
糖皮质激素在目前哮喘中是应用最广泛的药物。本实验用地塞米松灌胃进行治疗，发现地塞米松治疗组比哮喘组支气管和血管周围炎症细胞浸润减少，其总管壁厚度、内管壁厚度、平滑肌层厚度较哮喘组明显减少，差异有显著性，而与生理盐水对照组无明显差别。这提示口服地塞米松不仅具有抗炎作用，也有抑制气道重塑的作用。地塞米松治疗组BALF中TGF-β1浓度较哮喘组降低，IFN-γ浓度较哮喘组升高，上皮下表达α-SMA的MF相对量较哮喘组减少，支气管内管壁和平滑肌较哮喘组变薄，提示地塞米松可能通过减少TGF-β1，增加IFN-γ的产生，从而抑制MF增殖和表达，起到抗哮喘气道重塑的作用。但其确切的因果关系、糖皮质激素通过何种信号传导机制起作用、吸入糖皮质激素是否同样有效等问题，都有待进一步研究解决。
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