川芎嗪对兔肾缺血再灌注损伤超微结构改变的干预作用

【摘要】  目的:观察兔肾缺血再灌注损伤超微结构改变，探讨川芎嗪注射液的干预作用。方法:复制家兔肾缺血再灌注损伤模型，日本大耳白兔30只，随机均分为三组：假手术组（S），缺血再灌注组（IR）和缺血再灌注+川芎嗪注射液组（LZ）。使用透射显微镜观察各组肾组织标本超微结构的变化，作对比分析。结果:IR组主要异常改变有：①肾小球毛细血管腔狭窄，中性粒细胞附壁，大部分内皮细胞核固缩、染色体边集，细胞质内空泡形成，线粒体空泡变性。②多数脏层上皮细胞轻度核固缩，个别线粒体空泡变性，足突相互黏连，可见局灶性融合现象和微绒毛化现象。③近曲小管上皮细胞核固缩，胞质内出现较多空泡，溶酶体和致密颗粒沉积增多，线粒体数量减少，部分线粒体嵴断裂、空泡化，腔面微绒毛稀疏并有轻度肿胀现象。LZ组大部分标本的上述部位存在不同程度损伤性改变，但比IR组均明显减轻，其中近曲小管上皮细胞超微结构的改善较显著。结论:川芎嗪注射液可减轻肾缺血再灌注损伤所致的肾小球和肾小管超微结构的异常变化。

【关键词】  肾脏 缺血再灌注损伤 超微结构 川芎嗪注射液

    Abstract:  Objective: To observe the ultrastructural changes in renal tissue during renal ischemia reperfusion injury in rabbits and study the interfering effects of ligustrazine injection. Methods: The model of renal ischemia reperfusion injury of rabbit was established in vivo. Thirty rabbits were divided into three groups randomly: sham operation group (S group), ischemia reperfusion injury group (IR group) and ischemia reperfusion injury plus ligustrazine injection group (LZ group).The ultrastructural changes in renal tissue were observed under electron microscope in 5 hours after reperfusion. Results: The abnormal ultrastructure in IR group included that ①The cavities of the glomerular capillary narrowed, polymorphonuclear leucocytes adhered to the wall of the veessel, most of the endothelia showed nucleus pyknosis and staining thick, chromosome gathered near to nuclear membrance, vacuolization in cytoplasm and some mitochondia vacuolar degeneration were seen. ②Light degree nucleus pyknosis demonstrated in most of the visceral layer of the epithelia, individual mitochondrial vacuolar degeneration, foot process mutual adhesion were seen with focal coalescence and microvillus. ③epithelial cells of proximal convoluted tubule appeared nucleus pyknosis, more vacuolization was seen in cytoplasm, lysosome and dense granule in cytoplasm increased, number of mitochondrial vacuolization decreased, its crest partly fragmented, microvilli rarefaction and swelling were found. The ultrastructural injuries of the renal tissues in LZ group were obviously alleviated as compared to IR group and improvement of ultrastructure in epithelial cells of proximal tubule was notable. Conclusion: Ligustrazine injection can mitigate the abnormal changes of ultrastructure in glomerulus and tubules during renal ischemia reperfusion injury.

    Key words:  kidney; ischemia reperfusion injury; ultrastructure; ligustrazine injection

    肾脏是高血流量器官，其血流量约占心输出量的1/4～1/3，容易发生肾缺血再灌注损伤（renal ischemia reperfusion injury, RIRI）。RIRI是临床上肾移植、低血容量性休克等发生急性肾功能衰竭的主要病理生理基础，因此，深入揭示其损伤性变化并寻求防治方法十分重要。本研究复制实验兔RIRI模型，观察肾组织超微结构改变，并探讨常用中药川芎嗪注射液的作用。

    1  材料和方法

    1.1  模型制备  健康日本大耳白兔30只，雌雄不拘，体重1.7～2.7 kg，平均2.18 kg，由温州医学院实验动物中心提供。经耳缘静脉注射25%乌拉坦(4 ml/kg)麻醉，仰卧位固定于恒温手术台上，颈静脉插管滴注生理盐水0.5～1.5 ml/min。上腹部备皮、行正中切口，约5 cm，沿腹白线逐层分离，剪开腹膜，用湿纱布拨开肠管，暴露肾脏，玻璃分针分离肾动、静脉，用无创动脉夹夹闭左、右肾动脉，阻断血流1 h，然后松开动脉夹恢复血供5 h，复制肾缺血再灌注损伤模型。

    1.2  实验分组  动物随机分为三组：①缺血再灌注组(ischemia reperfusion，IR，n=10)，上述模型在夹闭肾动脉和恢复肾动脉血流时，自耳缘静脉注射生理盐水4 ml。②缺血再灌注+川芎嗪注射液组(ischemia reperfusion+ ligustrazinn，LZ，n=10)，夹闭肾动脉和恢复血流即刻，从耳缘静脉注射川芎嗪注射液（200 mgl/kg溶于4 ml生理盐水，山东长富洁净药业有限公司生产，批号03041711），其余同IR组。③假手术组(sham operation，S，n=10)，开腹后，仅暴露肾脏6 h，不阻断肾动脉，余同IR组。

    1.3  标本采集处理  各组实验兔在实验毕迅速摘取双肾，均于左肾靠近下极处切取约0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的组织2～3块，2.5%戊二醛前固定，0.2 mol/L磷酸缓冲液漂洗，1%锇酸后固定1 h，乙醇丙酮系列梯度脱水，Epon 812环氧树脂包埋，PT-XL型超薄切片机（美国RMC公司生产）切片，醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重染色，H-7500型透射电镜（日本HITACH公司生产）观察、拍照。

    2  结果

    透射电镜下全部标本肾组织超微结构显示清晰，各组改变情况分述如下。

    2.1  S组  肾组织超微结构基本正常。肾小球基底膜完整，毛细血管腔较舒张，内皮细胞结构正常，内皮窗孔清晰，内皮与基底膜连接紧密（见图1①，图2①）。脏层上皮细胞结构正常，线粒体嵴清晰，足突清晰、排列整齐、均匀，呈栅栏状（见图3①）。近曲小管上皮细胞核圆，核仁明显，染色质较淡，线粒体丰富，嵴清晰，少量溶酶体颗粒沉积，微绒毛丰富，排列致密有序，细胞基底部与基底膜连接紧密，细胞内褶细长而无扩张（见图4①）。

    2.2  IR组  肾组织超微结构损伤严重，肾小球毛细血管腔狭窄，中性粒细胞附壁现象明显，大部分内皮细胞存在不同程度的核固缩现象，部分严重者细胞核明显固缩，染色质成块状边集，细胞质内空泡形成较普遍，线粒体空泡变性较明显，部分内皮窗孔扩大，局部出现内皮胞质与基底膜分离现象（见图1②，图2②）。多数脏层上皮细胞出现核轻度固缩，部分线粒体空泡变性，足突排列紊乱、相互黏连，局灶性融合现象较多见，偶见微绒毛化现象（见图3②）。近曲小管上皮细胞核固缩现象较明显，胞质内出现较多空泡，溶酶体和致密颗粒沉积增多，线粒体数量有所减少，部分线粒体嵴断裂或模糊，有的甚至出现空泡化，腔面微绒毛稀疏并有轻度肿胀现象，细胞基底部与基底膜轻度分离，部分细胞内褶扩大（见图4②）。肾间质轻度水肿。

    2.3  LZ组  大部分肾组织超微结构存在不同程度损伤性改变，但比IR组明显减轻，如毛细血管腔较舒张，中性粒细胞附壁现象明显减少，仅见个别内皮细胞核出现轻度固缩现象，胞质内空泡形成较IR组有所减少，内皮窗孔无明显扩大，偶见内皮胞质与基底膜分离现象（见图1③，图2③）。大多数脏层上皮细胞核染色较淡，仅见个别核染色稍深，线粒体嵴较清晰，未见明显的空泡化现象，足突清晰，少部分排列稍紊乱，偶见局灶性足突融合现象（见图3③）。大多数近曲小管上皮细胞无明显异常改变，线粒体较丰富；少部分细胞核轻度固缩，线粒体轻度水肿，胞质出现少量空泡，溶酶体较多，但致密颗粒沉积不明显，微绒毛丰富，肿胀现象不明显（见图4③）。肾间质水肿现象不明显。

    3  讨论

    川芎嗪是从消散淤血、疏通血脉的常用中药川芎中提取的一种有效生物碱，具有扩张血管，降低血液黏度，改善血液流变性，增加冠状动脉和脑血管供血，改善全身微循环的作用[1]；而且能通过抑制氧化应激，降低血浆内皮素-1水平，对大鼠RIRI有保护作用[2]。因此，深入探讨其对RIRI干预作用及机制十分必要。

    肾小球滤过膜由带窗孔的内皮细胞、基底膜和脏层上皮细胞即足细胞（podocyte）构成，内皮细胞窗孔，足细胞足突呈镶嵌的并指状交叉覆盖在基底膜的外侧，足突间的空隙即裂孔（slit pore）连接于基底膜处裂孔隔膜（slit diagrame）而构成的滤过裂隙（filtration slit）是肾小球滤过屏障的主要结构基础，也是肾小球滤过屏障最重要的部分[3]。本实验观察到IR组肾小球内皮细胞窗孔扩大，会削弱孔径屏障（size barrier）作用，尤其是足细胞足突排列紊乱、相互黏连，局灶性融合和微绒毛化现象等严重损伤性改变，必然导致明显的滤过功能障碍[4，5]，这可能是肾缺血再灌注损伤后出现大量蛋白尿和相对分子质量大于白蛋白的大分子蛋白滤出的重要原因[6，7]。LZ组显示，肾小球内皮窗孔无明显扩大，上皮细胞足突清晰，仅少部分排列稍紊乱，偶见足突融合现象，提示川芎嗪能减轻RIRI造成的肾小球滤过结构的破坏。此外，内皮细胞和足细胞都存在的核固缩、线粒体空泡变性等异常改变得到一定程度的改善。

    近来研究表明，肾缺血再灌注后光镜下可见到：肾小管出现成列变平的上皮细胞，大量上皮细胞核染色深浓，一些上皮细胞与基底膜分离，近曲小管上皮细胞刷状缘稀疏和缺失等损伤性病理改变[8]。本实验进一步从超微结构观察到IR组的近曲小管上皮细胞不但有类似于上述的病变，如细胞核固缩，腔面微绒毛（光镜下的刷状缘）稀疏并有轻度肿胀现象，细胞基底部与基底膜轻度分离，部分细胞内褶扩大等变化，而且还有胞质内出现较多空泡，溶酶体和致密颗粒沉积增多，线粒体数量减少，部分线粒体嵴断裂，甚至出现空泡化。这些近曲小管上皮细胞变性是RIRI引起肾小管重吸收功能异常的结构基础。在使用川芎嗪进行干预后，发现大多数近曲小管上皮细胞无明显异常改变，特别是线粒体较丰富，溶酶体较多，腔面微绒毛丰富等，这些表明川芎嗪对RIRI导致的肾小管损害的改善尤为明显。因此可以认为这也是川芎嗪注射液使大鼠RIRI肾小管损伤的病理分级显著减轻[2]的基础。

【】
  [1] 胡国芬, 王建平. 川芎嗪的药理作用及临床应用进展[J]. 药物与临床, 2006, 6(10):773-774.

[2] 孙立江,李玉军,石景森. 川芎嗪在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中 的作用[J].临床泌尿外科杂志,2002,17(8):427-428.

[3] Mundel P, Shankland S J. Podocyte biology and response to injury [J]. J Am Soc Nephrol,2002,13(12):3005-3015.

[4] Ihalmo P, Palmen T, Ahola H, et al. Filtrin is a novel member of nephrin-like protein [J].Biochem Biophys Res Commum,2003, 300 (2):364-370.

[5] Ahola H, Heikkila E, Astrom E, et al. A novel protein, densin, expressed by glomerular podocyte [J]. J Am Soc Nephrol,2003,14 (7):1731-1737.

[6] Rajnoch J, Lodererova A, Szabo A, et al. Regulator of angioge- nesis renal ischemia / reperfusion injury in normotensive and hypertensive rats : effect of tacrolimus [J].Transplant Proc, 2005,37(1):352-354.

[7] 王新良,王新颖,牟兆新,等. 肾缺血再灌注对大鼠肾小球超微结构及负电荷位点的影响[J].河北医科大学学报,2005,26 (5):321-323.

[8] Lin F, Corders K, Li L, et al. Hematopoietic stem cells contri- bute to the regeneration of renal tubules after renal ischemia / reperfusion injury in mice [J]. J Am Soc Nephrol,2003,14(5): 1188-1199.