慢性低O2高CO2对大鼠认知功能与CREB表达的影响
【摘要】 目的:探讨慢性低O2高CO2诱导大鼠空间学习记忆改变及其可能机制。方法:将清洁级雄性SD大鼠随机分为对照组(C组，n=18)，低O2高CO2 2周组（2HH组，n=20）和低O2高CO2 4周组（4HH组，n=20）。Morris水迷宫观察动物空间学习记忆的变化，采用RT-PCR法观察大鼠海马及皮层区环磷酸腺苷反应单元结合蛋白(cAmp response element binding protein，CREB)mRNA的表达情况。结果:与C组比较，模型组大鼠寻找障台的平均逃避潜伏期延长：2HH组(38.59±8.35)s，4HH组(60.59±17.28)s；游泳总距离增加：2HH组（9893.4±1958.2）mm，4HH组（18077.6±6878.9）mm。模型组大鼠海马区CREBmRNA的表达较NC组相比均有减少，其中4HH组减少了43.1%(P<0.01)。结论:慢性低O2高CO2可导致大鼠空间学习记忆能力下降，并可能与海马区的CREBmRNA表达下调有关。
【关键词】 慢性低O2高CO2 学习记忆 CREB
Abstract: Objective: To explore the effect of chronic hypoxic hypercapnia on the alteration of learning-memory and the possible mechanism. Methods: Male SD rats were randomly divided into three groups: control group (C, n=18), 2-week (2HH, n=18), and 4-week (4HH, n=20) group. Rats in spatial reference task learning were assessed by the Morris water maze. The expression of CREBmRNA was determined with hybridization in situ. Results:Compared with NC group, rats exposed to chronic hypoxic hypercapnia displayed significant impairment in their performance assessed by two measures: mean escape latencies (2HH:38.59±8.35 s，4HH:60.59±17.28 s) and swim path distances(2HH：9893.45±1958.16 mm，4HH：18077.57±6878.85 mm). The expression of CREBmRNA in the hippocampus in the model groups was lower than those in the NC group, especially, decreased by 21.4% in 4HH (P<0.01). Conclusion: Chronic hypoxic hypercapnia can affect the expression of CREBmRNA which may be the factors contributing to learning-memory impairment.
Key words: chronic hypoxic hypercapnia; learning-memory; CREB
慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）急性期并发肺性脑病已被大家所认识和重视，但COPD患者慢性脑功能的损害却未引起人们足够的关注。由于COPD是多因素诱发的临床综合征,其发病机制复杂,使得动物模型模拟COPD的病理变化和临床特征十分困难。虽然国外已有研究表明，大多数COPD患者伴有明显的认知功能障碍[1]，但也仅限于临床研究，动物实验研究较少。已知慢性低O2高CO2是该疾病发生过程中重要的病理生理环节。本实验采用慢性低O2高CO2性肺动脉高压模型观察大鼠空间学习记忆的变化，并检测海马区的CREBmRNA的表达，报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要材料 常压低02高CO2舱（温州医学院肺心病研究室制），CYESIl型O2、CO2气体测定仪（上海市嘉定学联仪表厂），Medlab生物信号采集处理系统（南京美易科技有限公司），Morris 水迷宫及视频分析软件（上海吉量生物软件有限公司），梯度PCR仪（Effendorf公司），RT-PCR试剂盒（Fermentas公司）。
1.2 动物分组及模型制备[2] 将SD大鼠58只，体重180～220 g，随机分为3组：即正常对照组(C组，n=18)，低O2高CO2 2周组（2HH组，n=20），低O2高CO2 4周组（4HH组，n=20）。将模型组大鼠置于常压低O2高CO2舱内，通过N2调节舱内O2浓度，维持O2浓度在9%～11%，CO2浓度为5.5%～6.5%，每天8 h，每周6 d。动物饲养到规定时间后，用戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔麻醉，右心导管法测定平均肺动脉压(mPAP)、平均颈动脉（mCAP）。
1.3 Morris水迷宫行为学检测 Morris水迷宫由一直径130 cm，高50 cm的圆形水池组成，水深30 cm。将水池分成4个象限, 将站台固定置于第2象限中央，浸没于水下2 cm，水温（25±1）℃。水池周围贴有丰富的参照线索供大鼠用来定位平台。迷宫上方装有摄像头，大鼠行程可被记录下来。
各组大鼠称量体重后，行Morris水迷宫实验。实验共进行5 d，每天训练分上下午两次。大鼠按顺序从4个等分水池的点放入池中,放时使大鼠面向池壁,记录大鼠从入水到找到并爬上平台的时间。每次在平台上休息30 s再行下一次检测,如果在120 s内大鼠仍未能找到平台,则将其引导到平台,潜伏期记为120 s。各统计数据由上海吉量软件自动分析生成。学习记忆成绩用两个参数反映：平均逃避潜伏期（mean escape latency）和游泳总距离即找到平台游泳的轨迹(swim path distance)。
1.4 反转录多聚酶链式反应(RT-PCR) CREB引物根据Genebank资料，利用primer 5.0引物设计软件确定最优引物，然后经Blast匹对，由上海生工生物有限公司合成。CREB引物：上游为5'－TCA GCC GGG TAC TAC CAT TC-3'；下游为5'－TCT CTT GCT GCT TCC CTG TT-3'。 扩增产物片断长252bp。以GAPDH为内参照，引物序列: 上游为5'－TGC CAC TCA GAA GAC TGT GG-3'；下游为5'-CAA CGG ATA CAT TGG GGG TA－3'。扩增产物片断长182bp。
取大鼠海马脑组织匀浆后，提取1μl RNA样品，采用紫外分光光度法测定RNA纯度，以OD260/OD280的比值表示，要求比值在1.8～2.0之间。取2μg RNA，采用M-MLV逆转录酶, 按20μl体系，42 ℃，逆转录1 h。多聚酶反应总体系为20μl（包含GAPDH引物），所有引物退火温度为59℃，扩增30个循环，脂糖电泳，溴乙啶染色、紫外灯照相、凝胶图像扫描。以CREBmRNA与内参GAPDHmRNA灰度值比值（CREB/GAPDH）反应CREBmRNA表达水平。
1.5 统计学处理方法 全部数据经SPSS11.0统计软件进行统计分析。实验数据均以（±s）表示，经正态性检验后，多组间比较采用方差分析，用Homogeneity of Variances Test进行方差齐性检验，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Dennett's T3检验。
2 结果
2.1 低O2高CO2对大鼠mPAP、mCAP的影响 慢性低O2高CO2各组mPAP均高于正常对照组（P均<0.01），随着时间的延长，mPAP在慢性低O2高CO2 2 w时达最高，各组间mCAP无显著性差异（P>0.05），（见表1）。
2.2 低O2高CO2对各组大鼠空间学习记忆的影响 与正常对照组比较，慢性低O2高CO2各暴露组在Morris水迷宫中空间学习记忆能力下降：平均逃避潜伏期延长和游泳总距离增加。其中，以4HH组最明显，P<0.01。
2.3 RT-PCR法检测各组大鼠海马及皮层区CREB表达的变化 正常对照组大鼠离体海马及皮层区CREB mRNA表达水平较高，与内参GAPDH 基因水平灰度值比值（CREB/ GAPDH）分别为（4.84±0.84）、（2.74±0.62）。低O2高CO2各组CREB mRNA表达水平减低，与对照组相比较，其中4HH组表达减少了43.1%(P<0.01)。（见表3、图1-2）。
3 讨论
不同动物模型用于研究低O2对学习记忆的影响，主要有单纯低压低O2和间断低O2动物模型。经过模拟不同海拔高度的2 h和6 h低压低O2处理，有学者发现动物在Morris水迷宫中的空间和工作记忆，空间记忆的受损，其受损程度与模拟的海拔高度有关，海拔越高越严重[3]。另有实验设计的一种间歇性低O2(10%O2和21%O2 90 s钟交替供应)连续处理成年大鼠7 d后，大鼠在水迷宫中的空间学习能力受到严重损害[4]。我们的研究也发现：大鼠在Morris水迷宫中寻找障台的平均逃避潜伏期延长和游泳总距离增加，并随暴露时间的延长，其空间学习能力影响越明显。但是，也有少数资料显示一定条件的低O2可以促进动物学习记忆和增强运动能力[5]。这种矛盾结果可能与各实验采用的低O2程度和持续时间不同有关。在本实验中，由于叠加了高CO2因素，可能对学习记忆的损害更加明显。
慢性低O2高CO2可能通过改变动物的一些生理变化而影响学习记忆能力，如睡眠结构的紊乱、体重、脑血流的变化等。为排除上述影响因素，本实验在Morris水迷宫作业前对各组大鼠称重，发现无显著性差异。模型动物的mCAP无明显变化，说明其体循环压较稳定，也间接提示脑血供基本正常。
CREB是一种重要的核转录因子，其调节启动子中具有CRE基因转录。cAMP或钙浓度的升高等多种信号转导通路可启动CREB的磷酸化及其活化作用。 这种核转录因子具有调节包括学习记忆在内的广泛的生物学功能，是细胞内多种信号通路的一种关键成分。CREB属于转录因子bZIP超家族的一员。转录活化域主要是激酶诱导性结构域KID域(P框)。KID域内包含多种蛋白激酶的磷酸化识别位点，例如PKA和CaMK磷酸化识别位点Ser133，及CKⅡ的识别位点Ser133 和Ser129。KID磷酸化是CREB活化的关键条件，被认为在转录的起始过程至关重要,活化后的CREB通过一系列机制启动靶基因发生转录，继而调节脑的突触结构和功能的变化[6]。
长期记忆形成过程不但需要新蛋白质合成而且也需要新基因的转录，而构成长期记忆电生理基础的突触的LTP也同样需要这两个过程。在识别参与学习记忆和可塑性分子的研究中,发现软体动物海兔可显示出一种称为长时程易化的类似记忆的敏化行为，而且表明这种长时程易化需要cAMP-CREB通路的活动，从而提出了首个关于学习记忆的活动依赖性基因表达的机制[7]。
现今越来越多的实验证据表明, CREB参与学习记忆的过程，且发挥了重要作用。无论在可塑性形成过程的皮质神经元，还是在长时程增强刺激和记忆训练任务反应中的海马神经元均可检测到明显的CREB磷酸化和CRE报告基因的表达[8]。向大鼠海马区注入CREB的反义寡核苷酸导致其在Morris水迷宫中的空间学习缺陷[9]。Gozal等[10]研究表明在单纯间断低O2环境下，成年大鼠较幼年大鼠空间学习障碍更加明显，同时磷酸化的CREB表达水平更低。可见，CREB表达水平与学习记忆密切相关，能在一定程度上反映动物的学习记忆能力。
本研究结果显示，慢性低O2高CO2肺动脉高压大鼠海马及皮层区CREB表达水平减低，以4HH组海马最显著。结合Morris水迷宫结果的变化，提示CREB可能是慢性低O2高CO2导致学习记忆障碍的神经生物学机制之一。虽然，在本研究中，我们未能直接测定磷酸化CREB蛋白表达水平变化，但采用RT-PCR技术结合灰度值的变化对总CREB表达作了相对半定量分析，它的变化在一定程度上也反映了磷酸化CREB表达量的变化。
短暂的单纯低O2/缺血损伤可诱导磷酸化的CREB快速增高，并促使CRE的转录，然而，这种低氧诱导的磷酸化的CREB升高是暂时性的；若持续低O2或缺血，磷酸化的CREB水平将下降，核活性降低[11]。在本实验中，虽然未涉及细胞信号传导通路的研究，但我们推测低O2高CO2的程度和持续时间可能是CREB磷酸化的信号激活途径的重要决定因素。
【参考】
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