Rh弱D、Del的检测及意义

【摘要】  目的:探讨初筛为Rh(D)阴性样本中弱D、Del的检测及临床意义。方法: 采用常规血清学方法初筛Rh（D）血型，用微柱凝胶抗人球蛋白试验检测弱D，用吸收放散试验检测Del，用PCR-SSP法检测样本RhD基因8个外显子结构。结果: 常规血清学初筛Rh(D)阴性60例中经微柱凝胶抗人球蛋白试验确认为弱D4例，占6.67%；56例Rh（D）阴性标本经吸收放散试验后确认13例为Del，占21.67%；对其中2例弱D和5例Del标本的D基因8个外显子检测都完整存在，排除了弱D、Del的10例Rh（D）阴性标本其基因检测有完全缺失和部分缺失两种可能。结论: 为了临床输血安全，常规血清学检测Rh（D）阴性者，应当再用抗人球蛋白试验或吸收放散试验检测是否为弱D或Del。

【关键词】  Rh血型 吸收放散试验 D抗原 弱D Del

  Rh血型在临床输血中具有重要意义，也是人类红细胞血型系统中最为复杂、最具多态性的系统。D抗原抗体与输血的关系仅次于ABO血型，50%～75% Rh（D）阴性人接受Rh（D）阳性的血可能产生抗-D，导致免疫性输血反应。为了减少输血反应，正确检定Rh（D）阴性个体显得非常重要，现将我们的检测结果报告如下。

    1  资料和方法

    1.1  对象  2006年1月-2007年4月在本院用单克隆抗-D检测为Rh(D)阴性的60例样本。

    1.2  试剂和仪器

    1.2.1  RhD试剂：A、B2种人源抗-D血清，由本科提供，抗-D效价为1：256和1：128；a、b、c三种单克隆（IgM+IgG）抗-D分别为加拿大Dominion公司（批号为NDMG04203）、德国Biotest公司（批号为1210905）和法国DIAGAST公司（批号为410000）产品，由长春博德生物技术有限责任公司提供，均在有效期内使用。

    1.2.2  DNA制备：用TakaRa（大连宝生物工程有限公司产品）基因组DNA抽提试剂盒，扩增RhD基因2～7、9、10共8对外显子。

    1.2.3  “0”型RhD(+)试剂红细胞：随机取已知Rh(D)阳性“O”型红细胞3份，洗涤3次后混合配成0.8%红细胞悬液，当天配制。

    1.2.4  仪器：微柱凝胶抗球蛋白反应卡、专用孵育器、离心机均由瑞士达亚美公司提供。 

    1.3  方法  Rh（D）常规血型血清学初筛采用盐水试管法，按《人类红细胞血型学实用理论与实验技术》操作；弱D检测采用微柱凝胶间接抗人球法，按照说明书操作；Del检测采用阴性标本与两种不同来源的人源抗-D血清(A、B)和三种不同批号的单克隆抗-D(a、b、c)作吸收放散试验，按《人类红细胞血型学实用理论与实验技术》操作；D基因外显子检测采用序列特异性引物PCR（sequence specific primer polymerase chain reaction，PCR-SSP），按照说明书操作。

    2  结果

    初筛为Rh（D）阴性的60例样本，检出弱D 4例，占6.67%；排除弱D的56例Rh（D）阴性标本，检出Del型13例，占21.67%；其中2例弱D、5例Del型标本D基因8个外显子（2、3、4、5、6、7、9、10）检测都完整存在（见图1），排除了弱D、Del的10例Rh（D）阴性标本其基因检测有完全缺失和部分缺失（见图2）。

    3  讨论

    Rh血型中D抗原因能引起溶血性输血反应及新生儿溶血病而倍受重视，根据D抗原的数量和质量及抗原性不同的差异，可分为5种:D（常见的D抗原）、弱D（Weak D）、表位不完全型D（Partial D）、表位不完全型弱D、增强D。正常D(+)红细胞表面约有10 000～30 000个抗原表位，弱D型表位仅70～4 000个；弱D表现型的分子生物学基础主要是点变化引起的RhD膜内或跨膜区域而非细胞外的氨基酸改变，这些突变影响Rh（D）蛋白插入膜的效率，进而影响膜上的Rh（D）蛋白的数量，反映在这些红细胞上的表现是Rh（D）抗原数量的下降，这也是弱D表现型需要用间接抗人球蛋白试验来鉴定的原因。据报道，有0.2%～1%的人和更多的非洲裔美国人D抗原减弱[1]；本资料发现4例弱D表现型，即盐水法凝集反应为阴性，而微柱凝胶间接抗人球法阳性，占初筛Rh（D）阴性的6.67%，与文献[2]报道基本一致。

    Del型有非常弱的D抗原，是一种只能通过吸收放散试验才能检出的Rh（D）血型，还可以在约20%的Rh阴性个体中检出[3]。报道称此个体在湖北地区占22.67%[4]，海南地区占29.25%[5]，云南地区占20.65%[6]，安徽地区占15.6%[7]；本组资料中Del型占21.67%，与云南地区和湖北地区比例基本一致，低于海南地区比例，略高于安徽地区比例，提示Del型分布存在一定的地区差异。另外我们采用PCR-SSP法对其中2例弱D、5例Del型标本D基因8个外显子检测都完整存在，排除弱D、Del的10例Rh（D）阴性标本其基因检测有完全缺失和部分缺失两种情况，反映了从RhD基因水平看初筛为Rh（D）阴性个体中也确实包含有部分D阳性者。目前人们对初筛为Rh（D）阴性者会再检测弱D，但一般没有进一步检测Del型，虽然弱D表现型个体和Del型个体的D抗原表达都极弱，但一样均具有一定的免疫原性[8]，所以在Rh（D）检测时不可忽略弱D及Del的检测。

    在临床输血工作中，确定RhD阴性供血者时排除弱D及Del非常重要，弱D、Del都是弱D抗原，容易漏检，特别是Del，而真正的Rh（D）阴性血，不论是用于Rh（D）阴性人还是用于Rh（D）阳性人都不会产生溶血性输血反应，弱D、Del若被定为Rh（D）阴性而输给Rh阴性患者有可能会发生免疫应答，导致再次输血时可能发生输血反应。目前大部分血站提供给临床的Rh(D)阴性血液，没有检测Del或用PCR检测RhD基因及Del基因型，给RhD阴性患者的输血带来一定的安全隐患。因此，对初筛为Rh(D)阴性者进一步做间接抗人球及吸收放散试验判定是否为弱D/Del便显得相当重要，如果供血者是弱D/Del型，其血液应当作Rh阳性血使用；如果患者是弱D/Del型，则应视作Rh（D）阴性而输注Rh（D）阴性血。在现有的技术和条件下，尽量使Rh（D）阴性受血者输到名副其实的Rh（D）阴性血液，以确保输血安全、有效。

【文献】
  [1] Westhoff CM.The Rh blood group system in review: A newface for the next decade[J].Transfusion,2004,44(11):1663-1673.

[2] 李勇,马学严.实用血液免疫学[M].北京:技术出版社,2006:191.

[3] Lee YL,Chiou HL,Hu SN,et al.Analysis of RHD genes in Taiwanese RhD-negative donors by the multiplex PCR method[J].Clin Lab Anal,2003,17(3):80-84.

[4] 沈钢,章俊华,张浩,等.湖北汉族RhD阴性个体Rh表型及RHD基因多态性研究[J].输血杂志,2007,20（4）:304-306.

[5] 叶健忠,杨向萍,蔡于旭,等.海南汉族RhD阴性个体RHD基因研究[J].中国输血杂志,2005,18（2）:97-100.

[6] 蔡玲君,丁权,陈文仙,等.云南地区RhD阴性个体RHD基因研究[J]. 中国输血杂志,2006,19(6):452-453.