穿通支原体阳性胃癌组织超微病理观察

【摘要】  目的: 探讨胃癌组织感染穿通支原体（Mpe）后其超微病理形态学特征。方法: 对53例胃癌患者的血液和肿瘤组织进行Mpe分离培养与鉴定，并取5例Mpe检出阳性胃癌患者的肿瘤组织以及5例Mpe阴性胃癌患者的肿瘤组织在电镜下进行观察比较。结果: 53例胃癌患者中17例检出阳性（32.1%，17/53），与非肿瘤对照组（1.6%，1/64）比较，差异有显著性（P <0.01）。发现Mpe检出阳性胃癌组织出现不同程度的病理改变，表现为部分癌细胞间连接稀疏，细胞膜溶解缺损，线粒体空泡变性，内质网扩张，少数细胞溶解坏死，而凋亡现象减少；在Mpe检出阴性的胃癌患者的肿瘤组织中未能见到Mpe颗粒，见肿瘤细胞正常凋亡。结论: 胃癌患者中穿通支原体检出率显著增高，穿通支原体阳性肿瘤组织电镜下见溶解坏死。

【关键词】  穿通支原体 胃癌 电镜

    Abstract:  Objective: To explore the ultrastructural morphological characteristics of the gastric cancer infected with M. penetrans (Mpe). Methods: Blood and tumor tissues of patients with gastric cancer in 53 cases were isolated，cultured and identified. The tumor tissues of gastric cancer with positive Mpe were observed and compared under the elevctron microscope. Results: Mpe was detected positive in 17 cases from 53 patients of gastric cancer (32.1%，17/53) compared with non-tumor comtrol group (1.6%，1/64). There was significant difference between them (P＜0.01）.The pathological changes with different degrees appeared in the gastric cancerous tissues detected Mpe positive. Its manifestations were: some cancer cellular junctions were loosened，the cell membrance was dissolved and impaired，the mitochondria showed vacuolar degeneration and the endoplasmic reticulum was dilated，a handful of cells was dissolved even dead，but apoptosis phenomena were decreased. In the tissues detected M. penetrans negative，the M. penetrans was not found，and the cell apoptosis was as usual. Conclusion: The detection rate of Mpe in the gastric cancer patients is obviously increased，Cellular lysis and necrosis can be found in the gastric cancerous tissues with M. penetrans positive under the electron microscope.

    Key words:  Mycoplasma penetrans；gastric cancer；electron microscope

    穿通支原体（Mycoplasma  penetrans，Mpe）是近年来新发现的致病性支原体[1，2]，因穿入细胞感染而命名，具有独特棒锤样结构[2]。Lo等[1]于1992年首次报道从HIV阳性同性恋男性患者尿中分离到Mpe（GUT株）。Yanez等[2]于1999年首次报道从非HIV感染-抗磷脂综合征患者的血液、尿液和呼吸道的分泌物中分离到Mpe（HF1～3株）。我国赵季文等[3]在2000年首次报道成功分离穿通支原体。继而，有学者证实胃癌组织中支原体DNA检出率显著高于非胃癌患者，提示支原体感染可能与胃癌的发生有关[4，5]。我们曾首次报道从非HIV感染肿瘤患者的血液和肿瘤组织中分离检出Mpe[6]，并取分离自胃癌患者血液和肿瘤组织各1株Mpe经上海生工公司核酸序列分析证实核酸序列与Sasaki等（2002年）所报道的MpeHF-2标准菌株第1～第370间核苷酸序列完全一致，而且与Yanez等报道的HF-2株有同样棒锤样形态结构[6，7]。本研究旨在探讨穿通支原体感染后胃癌组织细胞的超微病理改变，为穿通支原体与胃癌相关性研究提供实验依据。

    1  材料和方法

    1.1  胃癌患者标本  取自2004年2月至2005年5月间经病理切片检查确诊为胃癌的手术患者（HIV-Ab阴性，年龄45～70岁，平均55岁）共计53例，提取患者的血液和肿瘤组织标本进行穿通支原体的分离培养及鉴定。与同期来我院就诊共计64例（44例体检人群血液和20例胃溃疡组织）非胃癌患者（作为对照组）相比较。患者和对照组分别来自浙江省温州医学院第一附属普外科和体检中心。

    1.2  菌株、培养基和试剂  已知穿通支原体菌株（GTU-546A1）由东南大学医学院流行病学教研室赵季文教授惠赠。[3]，分别制备改良SP-4、Uu与Mh支原体液体培养基。

    1.3  分离培养及菌落鉴定  53例胃癌患者的血液（常规抗凝，取血清）和肿瘤组织以及64例非肿瘤对照标本分别接种于改良SP-4和Uu、Mh液体培养基内。Uu、Mh液体培养基置37 ℃、5% CO2培养2 d，观察培养基颜色变化情况。改良SP-4液体培养基置37 ℃、5% CO2培养4～30 d，逐日观察并记录培养基颜色变化情况。若培养液颜色由红变黄、澄清，则判为“可疑阳性”，培养30 d仍不变色者，判培养阴性。取“可疑阳性”液体培养物过滤除菌、并分别取0.1 ml转种支原体固体培养基和普通固体培养基（以排除L菌），置5% CO2 37 oC培养24～72 h，显微镜下观察有无油煎蛋样菌落，并与同时接种的标准菌株相对照。初步鉴定菌株置-20 oC保存备用。

    1.4  PCR测定  取初筛阳性菌株并严格按说明书进行穿通支原体和发酵支原体的PCR检测，确认检出穿通支原体DNA，复查一次。

    1.5  电镜观察  取穿通支原体阳性（5例均为进展期胃癌）以及阴性（5例均为早期胃癌）胃癌患者肿瘤组织各5例，经2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，丙酮梯度脱水，Epon-812环氧树脂包埋，RMC-PT超薄切片机切片，半薄切片光镜定位于癌组织实质细胞部分，超薄切片经铅-铀双重染色，H-7500透射电镜下观察，拍片。另取经核酸序列印证穿通支原体阳性的菌株进行电镜负染技术处理，H-7500透射电镜下观察，拍片。

    1.6  统计学处理方法  组间比较采用卡方检验以及卡方校正检验。

    2  结果

    2.1  胃癌患者肿瘤组织、血液中穿通支原体的检出

    分离自胃癌患者血液和肿瘤组织的阳性菌株经PCR核实（见图1）。53例胃癌患者中，3例（占5.7%）同时从血液和肿瘤组织中检出Mpe，血液和肿瘤组织中总分离率均为18.9%（10/53）。胃癌组Mpe的总检出率为32.1%（17/53），与非肿瘤对照组1.6%（1/64）比较，差异有显著性（x2=20.73，P <0.01）。共计分别从胃癌患者的血液或肿瘤组织分离到20株Mpe（见表1）。无论胃癌患者的血液或肿瘤组织中均未检出Uu、Mh、发酵支原体和肺炎支原体。

    2.2  电镜观察结果  菌株负染电镜观察发现：大多数支原体呈现椭圆形或不规则形致密小颗粒，有的具有完整的包膜，并具有特征性的钩状结构（见图2a）。穿通支原体培养阴性的肿瘤组织电镜观察未发现Mpe感染现象。多数肿瘤细胞排列形成腺腔样结构，基膜不完整，可见微小浸润现象；细胞质内靠近游离面有多少不等的黏液颗粒，有的融合成湖状，细胞表面有少许微绒毛；大部分肿瘤细胞连接疏松，连接装置不成熟，可见少量核染色质固缩的凋亡肿瘤细胞（见图2b），溶解坏死的肿瘤细胞少见。肿瘤组织间质中胶原纤维排列较乱，部分可见溶解现象。穿通支原体培养阳性的肿瘤组织电镜观察发现大多数肿瘤细胞排列紊乱，腺腔样结构少见，基膜不完整，有的完全缺如，微小浸润现象较多见；细胞质内靠近游离面有多少不等的黏液颗粒，有的融合成湖状，内质网空泡变性（见图2c），细胞表面有少许微绒毛；大部分肿瘤细胞连接疏松，偶见细胞连接缺失现象，偶见Mpe通过其钩状部分穿入肿瘤细胞膜现象，该细胞内线粒体空泡变性较明显（见图2d）；有时可见受感染的细胞，其膜性细胞器均存在不同程度的空泡变性，有时可见形态各异的Mpe，外有三层膜包裹（见图2e），核染色质固缩现象较易见，部分肿瘤细胞出现溶解坏死现象（见图2f）。

    3  讨论

    众所周知，肿瘤的发生是一个多因素参与的复杂过程。某些病毒与肿瘤的发生密切相关这一观点已被医学界所公认。近年来系列的研究不断提示，支原体与肿瘤的发生也存在某种关联。如北京寿成超课题组曾报道胃癌组猪鼻支原体的检出明显高于胃良性疾病组[5]。1995年Tsa等和1997年Zhang等报道穿通支原体感染小鼠胚胎细胞C3H 6周引起C3H细胞形态学改变，不伴有恶变特征，但至11周即出现恶性改变，18周之后转化不可逆转，染色体发生畸变，提示Mpe存在致癌潜能[5，6]。我们曾报道膀胱移行细胞癌、宫颈癌以及胃癌和直肠癌患者的血液和肿瘤组织Mpe检出率较非癌组显著升高[6，7]。

    我们进一步从胃癌患者的血液和肿瘤组织中分离检出Mpe，并分别选取5例Mpe阳性和5例Mpe 阴性的胃癌患者的肿瘤组织进行透射电镜观察比较，进一步探讨Mpe感染在胃癌的肿瘤细胞坏死及浸润转移中的作用。我们发现，在Mpe阴性的胃癌患者的肿瘤组织中未能见到Mpe颗粒，且肿瘤细胞的病理变化与正常无异，细胞凋亡现象易见；而在Mpe阳性的肿瘤组织中容易见到Mpe感染现象，并且还发现Mpe通过其钩状部分穿入肿瘤细胞膜现象，部分肿瘤细胞内发现形态各异的Mpe包涵体以及形态各异的Mpe颗粒散在分布，这是Mpe直接侵入肿瘤细胞的有力证据。而受Mpe感染的肿瘤细胞间连接比阴性感染的稀疏，甚至出现细胞连接缺失现象，部分肿瘤细胞内线粒体、内质网等膜性细胞器发生空泡变性，并且可见肿瘤细胞溶解坏死，但凋亡细胞数量比阴性的少，这说明Mpe能够引起宿主细胞的变性或坏死，并具有阻止细胞凋亡的作用，此结果与 Roske等[8]报道的发酵支原体和穿通支原体能阻止细胞的凋亡，诱导IL-3依赖的32D血细胞在Mpe感染的3～4周后发生转化相一致。同时，Mpe阳性组肿瘤组织间质中胶原纤维紊乱、溶解。然而，Mpe阴性组未见此现象。

    支原体的感染与肿瘤的发生、具有相关性[9，10]。本实验中53例胃癌患者，17例(占32.1%)Mpe阳性，究竟是由于穿通支原体的长期慢性感染诱导肿瘤的发生，还是肿瘤患者免疫力低下导致穿通支原体感染，它与肿瘤细胞浸润转移是否存在关联，还有待进一步探讨。根据以上观察结果，我们做以下推测：由于胃癌患者免疫力低下，从而诱发潜伏在体内的机会性感染微生物如Mpe大量繁殖，通过血液流经全身，并停留在胃癌肿瘤组织内，通过其特殊的钩状结构，黏附在胃癌细胞表面，但此时对胃癌细胞膜可能还没有造成明显损伤；一旦机体免疫力进一步下降，则Mpe通过其钩状结构与胃癌细胞间相互作用，引起细胞膜溶解破损，Mpe便直接进入肿瘤细胞体内。进入肿瘤细胞内的Mpe经过出芽繁殖或以包涵体形式游离于胞质内，或直接攻击细胞质内的细胞器如线粒体、内质网等膜性结构，引起线粒体、内质网出现空泡变性，严重者导致被侵细胞溶解坏死[8]。

    受感染的肿瘤细胞间连接减少，部分肿瘤细胞变性坏死，肿瘤细胞容易脱落，再加上基膜断裂，间质胶原纤维溶解，为胃癌细胞向周边组织浸润生长提供有利条件，一旦浸润血管或淋巴管，就容易引起肿瘤的转移生长，这也许是Mpe阳性胃癌患者容易发生转移的因素之一，也可能是胃癌恶性程度加大的直接或间接原因。有报道认为支原体感染不但能够促进胚胎细胞恶性转化，而且具有促进肿瘤细胞浸润转移的作用[8]，此结果与报道相符合。

【】
  [1] Lo SC,Hayes MM, Tully JG, et al. Mycoplasma penetrans sp.nov, from the urogenital tract of patients with AIDS[J]. Int JSyst Bacteriol,1992,42(3):357-364.

[2] Yanez A,Cedillo L,Neyrolles O,et al. Mycoplasma penetransbacteremia and primary antiphospholipid syndrome[J].EmergInfect Dis,1999,5(1):164-167.

[3] 赵季文,贾成梅,糜祖煌,等.我国首次成功分离穿通支原体和发酵支原体的报告[J].疾病监测,2000,15(11):405-407.

[4] Kwon HJ,Kang JO,ChosH,et al. Presence of humanmycoplasma DNA in gastric tissuesamples from Korean chronicgastritis patients[J]. Cancer Sci,2004,95(4):311-315.

[5] Huang S, Li JY, Wu J, et al. Mycoplasma infections and different human carcinomas[J].World J Gastroenterol,2001,7(2):266-269.

[6] Zhou LP,Wen XS,Zhu YY,et al.Mycoplasma penetrans wereisolated from blood and tumor tissue of cancer patients[J]. U.SChinese Journal of Lymphology and Oncology,2007,6(3):129-136.

[7] 周丽萍,余志贤,蓝升红,等.生殖道、胃肠道肿瘤病人的肿瘤组织和血液同时分离到穿通支原体[J].中华医学杂志,2006,86(26):1862-1864.

[8] Roske K, Blanchard A, Chambaud I. Phase variation amongmajor surface antigens of Mycoplasma penetrans[J]. InfectImmun,2001,69(12):7642-7651.

[9] Rivera-Tapia1 JA, Rodríguez-Preval N. Possible role ofmy coplasmas in pathogenesis of gastrointestinal diseases[J].RevBiomed,2006,17:132-139.

[10]Zhang S, Wear DJ, Lo S. Mycoplasmal infections alter geneexpression in cultured human prostatic and cervical epithelialcells[J]. FEMS Immunol Med Microbiol,2000,27(1):43-50.