纳米银胶标记的DNA电化学传感器制备及应用

【摘要】  目的:研究一种新型的纳米银胶标记DNA电化学传感器的制备及应用。方法:通过将纳米银胶标记于人工合成的5'端-巯基修饰的寡聚核苷酸片段上，制成银胶DNA电化学探针。利用阳极溶出伏安法检测标记于DNA末端的Ag+，实现对特定序列DNA的测定。结果:经过实验条件的优化，测定DNA浓度在1.0×10-9～6.0×10-7 mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为5.0×10-10 mol/L。结论:该DNA电化学传感器响应快速、灵敏度高、稳定性好，适合于生物分析。

【关键词】  纳米银胶；电化学DNA传感器；杂交检测；阳极溶出法

    生物样品中特定DNA序列的测定在生物医学领域具有重要意义[1]，其结果可用于对遗传性和传染性疾病进行鉴别和检测。在众多的杂交检测方法中，放射性同位素标记法存在着放射性污染等弊端，而非放射性标记法如荧光、化学发光和生物素标记方法的检测仪器昂贵，难以实现自动化， 且标记过程繁琐复杂[2]。DNA电化学传感器因具有简便快速、不破坏测试样品、不受溶液颜色影响等优点，已逐渐成为分子生物学研究中直接进行DNA序列检测的方法之一[3，4]。银胶是一种纳米材料，银胶粒子粒径小，比表面积大，表面反应活性高，从而具有良好的催化活性[5，6]。本研究将纳米银胶标记于人工合成的5'端-巯基修饰的寡聚核苷酸片段上，制成了高灵敏度、高选择性DNA电化学传感器，实现了对特定序列DNA的检测。

    1  材料和方法

    1.1  仪器和试剂  CHI650B电化学分析仪（上海辰华仪器有限公司生产），原子力显微镜（Nanoscope Ⅲa，Digitao Instruments,Inc. Santa Barbara. CA），紫外-可见分光光度计（Varian，美国）。

    人工合成的24个碱基的寡聚核苷酸片段(上海生工生物工程公司提供)：

    探针序列：5'-HS-(CH2)6-GAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGA-3' 

    (SH-ssDNA)

    互补靶序列：5'-TCGACCTGAAATGTTGCGCCGCTC-3'  (ssDNA)

    非互补序列：5'-GAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGA-3'  (ncDNA)

    硝酸银、吡咯溶液（分析纯，上海化学试剂公司生产），硼氢化钠（分析纯，Fluka公司生产），0.1 mol/L NaCl和10 mmol/L磷酸盐的混合液（pH=7.0）为缓冲溶液。制备银溶胶用去离子水（Millipore 18 MΩ），其余用水均采用二次蒸馏水。

    1.2  纳米银胶的制备  制备银溶胶所用的玻璃器皿均经铬酸洗液浸洗，最后用去离子水（Millipore 18 MΩ）荡洗几次。银溶胶的制备方法参见[5]，即将30 ml 1.5×10-3 mol/L NaBH4溶液置于冰浴中，在剧烈搅拌下，分批滴加入10 ml 1.0×103 mol/L AgNO3溶液，继续搅拌1/2 h，制得的溶胶呈黄色透明状，在4 ℃下可稳定保存约1个月。用原子力显微镜对银溶胶粒子的形状和大小进行了表征，结果显示银溶胶粒子呈球状，均匀地分布在溶胶中，其纳米银粒子的尺寸在8～15 nm之间。

    1.3  纳米银胶标记DNA探针的制备  将探针序列SH-ssDNA溶解在新制备的银胶溶液中，SH-ssDNA的浓度为1.0×10-5 mo1/L，室温下静置20 h，使SH-ssDNA与纳米银胶颗粒充分发生自组作用。然后将该溶液在15 000 r/min下高速离心30 min，除去上层清液，用磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀，再离心分离，以除去未反应的过量寡聚核苷酸，所得的探针用磷酸盐缓冲溶液稀释成一定的浓度，于0～5 ℃保存，备用。

    1.4  待测DNA在玻碳电极上的固定  参照文献[7]，将玻碳电极用0.05 mm Al2O3粉末在麂皮上打磨至光亮，并依次在丙酮、1:1 NaOH溶液、1:1硝酸溶液以及二次蒸馏水中超声清洗。采用三电极体系，把电极插入含有0.1 mo1/L KCl和0.05 mo1/L吡咯溶液中，以50 mV/s 的速度在0～+0.7 V的电位范围内循环伏安扫描15圈后，在电极表面形成一层均匀的薄膜，吡咯被电化学聚合到电极表面。取出电极，把它浸入到待测DNA溶液中，在+0.5 V恒电位下吸附200 s，通过静电作用，DNA被固定在聚吡咯修饰的玻碳电极表面。电极用KCl溶液冲洗后以除去多余的未固定的DNA。

    1.5  杂交反应  将固定了不同单链DNA片段的玻碳电极同时浸入到依据上述1.4制得的纳米银胶标记DNA探针溶液中进行杂交反应，40 ℃下均匀搅拌1 h。取出后，清洗除去表面吸附的未杂交的纳米银胶标记探针。

    1.6  银的氧化溶解及测定  将杂交后结合了纳米银胶的玻碳电极浸入50%的HNO3溶液中，振荡使银氧化溶解，等黄色的纳米银胶逐渐变成无色的溶液时，表明胶体中的Ag原子已经被HNO3氧化成Ag+。取出电极后加入0.01mol/L HNO3-KNO3溶液作为支持电解质底液，以铂丝为对电极，氯化银电极为参比电极（用双盐桥将其与底液隔离，避免不断释放的C1-与银形成AgCl沉淀干扰测定），玻碳电极为工作电极，采用阳极溶出伏安法（ASV）对Ag+进行电化学检测。

    2  结果和讨论

    2.1  银胶标记DNA探针的性质  银胶和银胶标记DNA探针的紫外-可见吸收曲线测定结果表明，两者在390 nm处都有一个最大吸收峰，而银胶标记DNA探针在256 nm处多出现了一个DNA的特征吸收峰。通过比较可知，DNA通过巯基与银胶发生了作用，说明银胶已经标记在SH-ssDNA的末端。

    2.2  阳极溶出伏安法(ASV)对Ag+的检测  ASV法在微量金属离子的检测中显示了很大的优越性。一般来说，ASV法是指首先控制工作电极在某一适当的负电位值，使被测金属离子在电极上还原析出，然后反向扫描，使电极电位向正方向移动，于是被测离子溶解回到试液中，记录溶出过程中的电流-电位曲线，从而进行定量分析。杂交反应后，银胶标记DNA探针的量可以通过检测银的电化学信号来确定。因此，对特定序列DNA的检测就转化为对溶解在HNO3中的Ag+的ASV法测定。

    图1为玻碳电极在0.01 mol/L HNO3-KNO3底液中，测定 1 mmol/L AgNO3标准溶液的阳极溶出伏安曲线。从图中可知在+0.34 V 处有一溶出峰，它是富集在电极表面银从Ag0-Ag+的特征氧化峰。

    2.3  电解富集电位和时间的影响  ASV法有一个对被测物质进行预富集的过程，大大提高了检测的灵敏度。其中电解富集的电位和时间是影响灵敏度的两大要素。

    实验结果表明，当固定电解富集时间为3 min时，随着富集电位从-0.1 V向-0.5 V变化时，得到的银溶出峰电流不断增大，这是由于单位时间内在电极上析出的物质的量增多所致。当电位进一步负移时，溶出峰电流不再增大，达到了极限值。因此-0.5 V被选为最佳富集电位。同时我们固定电解富集电位为-0.5 V，发现银的溶出峰电流随富集时间的增长而增大。实验中，我们选择了3 min作为还原富集时间。

    2.4  杂交温度和杂交时间的影响  在杂交过程中，温度的变化直接影响着反应的程度，当杂交温度过低时，溶液中的目标DNA扩散缓慢，从而影响了互补链碱基之间的配对；但是温度过高又会使DNA变性，影响杂交的程度。在本实验中当温度在35 ℃以下时，几乎没有杂交反应。温度在35～40 ℃的范围内时，杂交信号增加；当温度高于40 ℃后，杂交信号快速减小，因此选择杂交温度为40 ℃。杂交过程中，随着时间的增加，杂交程度也增加，产生的峰电流越大，实验表明1 h后峰电流趋于稳定，杂交趋于饱和，故我们选择杂交的时间为1 h。

    2.5  特异性实验  DNA 的杂交反应具有高度的专一性，将相同浓度（5.0×10-8 mol/L）与 探针序列完全互补的（ssDNA）或完全非互补的（ncDNA）分别固定在聚吡咯修饰的玻碳电极表面，然后与银胶标记DNA探针进行杂交分析。结果表明只有互补ssDNA产生峰电流响应信号，而非互补ncDNA几乎没有电流信号，说明此法可以测定特定序列DNA。

    2.6  线性关系、检测限及重现性  配制一系列不同浓度的待测ssDNA溶液，分别固定在聚吡咯修饰的玻碳电极表面，再与银胶标记DNA探针溶液进行杂交分析。实验证明在1.0×10-9～6.0×10-7 mol/L的浓度范围内，被测ssDNA的浓度与杂交后银的峰电流信号呈线性关系，回归方程为 I=1.537×10-7c+0.147（I为银的峰电流，单位为μA；c为被测DNA的浓度，单位为mol/L），相关系数r=0.9931。根据3倍于噪声信号，对特定序列ssDNA的检测限为5.0×10-10 mol/L。连续5次测定5.0×10-8 mol/L DNA的相对标准偏差是3.5%，说明本法有较好的重现性。

【】
  [1] 庞代文，颜蔚. 基因传感技术及目前存在的问题和对策[J]. 高等学校化学学报, 2001, 22(3):389-395.

[2] 蔡宏,王延琴,何品刚,等. 基于纳米金胶标记DNA探针的电化学DNA传感器研究[J]. 高等学校化学学报, 2003, 24(8):1390-1394.

[3] 唐婷,彭图治,时巧翠. 碳纳米管修饰金电极检测特定序列DNA [J]. 化学学报, 2005，63(22):2042-2046.

[4] 漆红兰,张成孝. 纳米粒子在电化学DNA生物传感器研究中的应用[J]. 化学进展, 2005, 17(5):911-915.

[5] 林丽, 仇佩虹, 杨丽珠, 等. 纳米银粒子修饰电极法测定血红蛋白[J]. 分析化学,2006,34(1): 31-34.

[6] Ren C, Song Y, Li Z, et al. Hydrogen peroxide sensor based on horseradish peroxidase immobilized on a silver nanoparticles/cysteamine/gold electrode [J]. Anal Bioanal Chem, 2005, 381(6):1179-1185.

[7] Zhu N, Zhang A, He P, et al. Cadmium sulfide nanocluster-based electrochemical stripping detection of DNA hybrid-ization [J]. Analyst, 2003, 128(3):260-264.