黄体生成素β亚基Trp8Arg 和Ile15Thr突变与多囊卵巢综合征

            作者：张二红， 梁晓燕， 曾海涛， 杜静， 骆春启， 庄广伦

【摘要】  　　【目的】 探讨黄体生成素（luteinizing hormone, LH）β亚基Trp8Arg 和Ile15Thr突变与人多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)的关系。【方法】采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析（PCR－RFLP）技术检测113例PCOS患者和68例正常妇女，分析LHβ亚基基因突变与PCOS之间的关系。【结果】 PCOS组血清LH、睾酮、游离睾酮及胰岛素抵抗指数（HOMA－IR）均显著高于对照组（P＜ 0.05）。在两组中均有β亚基突变发现，Trp8Arg 突变率在PCOS组16例（14.16％），对照组4例（5.88％）；Ile15Thr 突变率在PCOS组15例（13.27％），对照组4例（5.88％），突变频率在两组间没有统计学差异。两组中突变杂合子与非突变者性激素水平没有统计学差异。【结论】 PCOS患者促性腺激素和性激素水平发生紊乱。PCOS组LHβ亚基Trp8Arg 和Ile15Thr突变发生率高于正常对照组，但差异未有统计学意义。本研究未发现突变杂合子改变了LH的生物学功能。

【关键词】  多囊卵巢综合征； 黄体生成素； 基因； 点突变

    Abstract: 【Objective】 To determine any association between the point mutation of Trp8Arg and Ile15Thr in the exons 2 of LH gene and the polycystic ovary syndrome (PCOS) in Chinese women.【Method】 A total of 113 PCOS patients and 68 normal ovulatory women with regular menstrual cycles were recruited. The presence of the mutations of the human LH β-subunit was screened by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). 【Result】The serum level of luteinizing hormone (LH), testosterone, free testosterone and HOMA-IR in PCOS group were higher than that in control group, which were statistically significant (P< 0.005). The mutation rate of Trp8Arg detected in the PCOS group (16 cases) and control group (4 cases) were 14.16% and 5.88%, relatively, but the difference between the two groups was not statistically significant. The mutation rate of Ile15Thr detected in the PCOS group (15 cases) and control group (4 cases) were 13.27% and 5.88%, relatively. The difference of frequency of mutation was not significant also. There was also no difference found in hormonal levels between the heterozygous and wild type in PCOS group and control group. 【Conclusion】 PCOS patients have disorders in their gonadotropin and sexual hormone levels. The frequency of the variant LH β-subunit gene in the PCOS group was higher than that in the control group, but the difference was not significant. The presence of heterozygous of the variant did not alter the bioactivity of LH.

    Key words:  polycystic ovary syndrome; luteinizing hormone; gene; dot mutation

   多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是临床常见的妇科内分泌疾病。近年来研究发现PCOS的发生有家族聚集性,认为PCOS主要以常染色体显性方式遗传,由遗传因素和环境因素共同造成[1,2]。黄体生成素（luteinizing hormone, LH）增高是PCOS患者常见内分泌改变之一。LH基因突变有可能在PCOS的遗传学机制方面起作用。LH基因Trp8Arg和Ile15Thr突变是国外学者研究较多的一种突变，其与PCOS的关系尚有争议。本文主要研究此突变与中国PCOS妇女发病的关系。

    1   材料与方法

    1.1   研究对象

    2004年5月至2005年3月在中山大学附属第一生殖中心及妇产科门诊就诊的PCOS患者113例, 诊断标准2003年Rotterdam标准[3]。68例月经周期正常妇女作为对照。月经期第2～5天抽血测定基础性激素、空腹胰岛素、血糖等。闭经患者予黄体酮撤退来月经后抽血检测。测定身高体质量并收集相关资料。

    1.2   研究方法

    1.2.1   基因组DNA的提取   抽取EDTA抗凝外周静脉血2 mL，DNA抽提按中山大学达安基因诊断中心DNA抽提试剂盒说明进行。

    1.2.2   聚合酶链反应(PCR)   引物由上海博亚公司合成，序列为LHF：5′-GAA GCA GTG TCC TTG TCC CA-3；LHR: 5′-GAA GAG GAG GCC TGA GAG TT-3′[4]，扩增产物660 bp。PCR反应体系：5 ×buffer 10 μL、10 × dNTP 1 μL、引物各0.5 μL、Taq酶1.5 μL、模板DNA 2 μL、双蒸水加至50 μL。93 ℃ 3 min预变性，93 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，进行35个循环，72 ℃再延伸7 min。

    1.2.3   限制性片段长度多态性分析(RFLP)   NcoⅠ内切酶、ForkⅠ内切酶购自NEB公司。两种酶切反应体系及反应条件一致。PCR产物10 μL、10×buffer 2.5 μL、内切酶2 μL、加水至25 μL以上物质混匀后置37℃水浴，消化2 h。酶切产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染。

    1.2.4   PCR产物的回收纯化和序列测定   由上海博亚公司测序。

    1.3   统计方法

    采用SPSS 11.0统计软件处理数据，各参数采用表示，各均数之间的比较用t 检验。两组间基因突变频率的比较采用χ2检验及Fisher’s精确概率检验。

    2   结   果

    2.1   两组观察对象的内分泌特征及激素水平

    PCOS组与对照组年龄相匹配，基础LH、睾酮（testosterone, T）、游离睾酮（free testosterone, free T）、HOMA－IR［胰岛素抵抗指数=空腹胰岛素（mU/L）×空腹血糖（mmol/L）/22.5］有统计学差异（P＜0.05，数据略），符合PCOS疾病特点。

    2.2   外周血样本目的基因PCR的检测

    2.3   限制性片段长度多态性分析结果

    LHβ亚单位Trp8Arg 和Ile15Thr突变是第2外显子内存在2个不同位置的错义突变。限制性内切酶NcoⅠ消化PCR产物，野生型(W－LH)显示475 bp、100 bp和85 bp电泳条带，Trp8Arg突变纯合子显示475 bp和185 bp电泳条带，杂合子显示475 bp、185 bp、100 bp和85 bp电泳条带（图2）。限制性内切酶FokⅠ消化PCR产物，W－LH显示390 bp、176 bp、51 bp和43 bp电泳条带，Ile15Thr突变纯合子显示433 bp、176 bp和51 bp电泳条带，突变杂合子显示433 bp、390 bp、176 bp、51 bp和43 bp电泳条带（图3）。突变经测序证实，序列图见图4。突变在两组中均有发现，通过检验，所调查人群基因型分布符合Hardy－Weinberg平衡（P>0.05）。Trp8Arg突变和Ile15Thr突变的发生率在两组中比较无统计学差异（P ＞0.05;表1，2)。

    2.4   突变杂合子PCR产物测序图

    2.5   PCOS组LHβ基因突变与主要临床代谢特点的关系

    根据体质量指数（Body mass index, BMI）进行分类，≥25 为肥胖组。在PCOS组及对照组中肥胖与非肥胖者LHTrp8Arg突变和Ile15Thr突变频率无统计学差异（P ＞0.05）。比较了PCOS患者中LH β基因突变携带者（即突变型v-LH）与非突变携带者（即野生型w-LH））之间的主要临床特点发现:两组的年龄、平均体质量指数、基础性激素水平均无显著性差异（表3）。

    3   讨   论

    生殖系统的正常发育和功能依赖于激素及因子间复杂的相互作用。本研究结果显示PCOS患者促性腺激素和性激素水平发生紊乱。经统计发现PCOS患者LH、T及游离T水平高于对照组。LH能激活卵巢卵泡膜细胞的细胞色素P450c17，将胆固醇转化为雄激素，促进高雄激素的发生。结果还提示PCOS患者存在胰岛素抵抗现象，胰岛素参于性激素的代谢和调节，降低性激素结合球蛋白使游离雄激素升高，促进并增强LH所诱发的的卵巢间质雄激素分泌，促进高雄激素血症的发生[5]。

    LH 属糖蛋白激素，由α亚基和β亚基形成异二聚体。激素与特异性受体的相互作用及信号的转导由β亚基决定。LHβ亚单位由单个基因编码，该基因定位于19q13.3，全长1.65 kb，由3个外显子组成,LHβ基因发生突变可能导致与黄体功能缺陷的一系列表型如不排卵、黄体功能不足、未成熟卵泡排卵等，机制可能是突变的LH不能与受体正常作用。既往研究表明LHβ基因Trp8Arg和Ile15Thr突变15位密码子（ATC→ACC）突变增加了一个糖基化作用位点，介导了Asn寡糖侧链，新增的糖基化位点可能避免β亚基发生二硫键连接的自身聚合。形成硫化碳水化合物与肝脏的受体结合，从而更快地从血中被清除，与其半衰期缩短有关[6]。对重组V－LH表达蛋白研究表明密码子8（TGG→CGG）突变改变了LH分子结构及免疫反应性[7]，造成许多常用的单克隆抗体不能检测出LH的真实水平,对临床工作产生干扰。LHβ基因Trp8Arg和Ile15Thr突变的病理生理意义至今尚不明确。推论突变可能与性腺的功能变化有关。

    日本报道散发病例变异型纯合子LH妇女有复发性流产，月经紊乱，不孕及PCOS。Takahashi研究发现LHβ基因变异与妇女不育,卵巢早衰有关[8]。对世界范围的这种基因突变携带者频率进行分析，在不育及健康人群中均有发现，突变基因携带率从0到53.5％不等。频率大范围的波动提示这种多样性在一定环境下对人类进化是有利的[9,10]。本研究中两种突变在月经周期正常妇女及PCOS组中均有发现, PCOS组中频率高于正常对照组，但差异未达到统计学意义。比较了PCOS患者中LHβ基因突变型与野生型之间的主要临床特点发现，两组的年龄、平均体质量指数、基础性激素水平均无显著性差异；对照组中LHβ基因突变型与野生型两组之间的年龄、平均体质量指数、基础性激素水平均无显著性差异（P ＞0.05，数据略）。此次研究中没有发现突变的杂合子PCOS患者与非突变PCOS患者在雄激素水平的差异。因为没有纯合子，本研究尚不能说明突变型LH的体内生物活性变化情况。此突变与PCOS的关系尚需要进一步的研究阐明。

【】
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