嘌呤受体P2X7激活谷氨酸受体NMDA引起视网膜神经节细胞凋亡
作者：张秀兰 张梅 胡慧玲 Claire H. Mitchell 葛坚
【摘要】 【目的】 研究嘌呤受体P2X7和谷氨酸受体NMDA激活诱导大鼠视网膜神经节细胞（RGC）凋亡的相互作用机制。 【方法】 ①对新生Long-Evan大鼠进行上丘注射荧光标记物Aminostilbamidine标记RGC，NMDA受体通道拮抗剂MK-801、APV和Memantine分别与P2X7受体激动剂BzATP共培养，检测它们对体外培养RGC存活率的影响；②未经Aminostilbamidine标记的新生大鼠RGC，以10 μmol/L钙离子（Ca2+）荧光染料Fura-2标记后，利用Ca2+影像测定仪分别测定BzATP及三种NMDA拮抗剂对RGC胞内Ca2+浓度的影响。 【结果】 （1）三种NMDA拮抗剂均分别不同程度阻断BzATP引起的RGC凋亡。BzATP在50 μmol/L 浓度下，约杀死（36%±2%）的RGC，而MK-801（10 μmol/L）、APV（100 μmol/L）和Memantine（100 μmol/L）则均可明显减轻BzATP对RGC的毒性作用，使RGC 存活率分别提高至（96% ± 4%，P < 0.001）、（80% ± 5%，P= 0.010）和（76%±9%，P =0.144）。（2）BzATP可引起RGC 胞内Ca2+持续升高，在50 μmol/L浓度下可使胞内Ca2+升高至（1183±109）nmol/L。而MK-801（10 μmol/L）、APV（300 μmol/L）和Memantine（30 μmol/L）则均可显著降低BzATP介导的Ca2+升高幅度，分别为（76% ± 7%，P =0.003）、（51%± 17%，P =0.033）和（55% ± 16%，P =0.025）。 【结论】 NMDA受体拮抗剂可阻断嘌呤受体P2X7激活诱导的RGC凋亡。P2X7受体和NMDA受体通道激活可能共同介导着兴奋性神经毒作用且P2X7在NMDA受体的上一环节先起作用。
【关键词】 视网膜神经节细胞； P2X7受体； NMDA
Abstract: 【Objective】 To demonstrate if P2X7 receptor and N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor link to initiate retinal ganglion cells (RGC) death. 【Methods】 (1) Long-Evan neonatal rats were back labeled with Aminostilbamidine to identify RGC. RGC cell viability was then examined using P2X7 receptor agonist BzATP and NMDA receptor antagonists MK-801, APV and Memantine. (2) RGC were dissociated from the retinas of unlabeled neonatal rats and were loaded with Fura-2, an intracellular calcium indicator. BzATP and three NMDA receptor antagonists were applied to RGC to examine their effects on intracellular Ca2+ levels using Ca2+ imaging system. 【Results】 (1) BzATP (50 μmol/L) could kill about (36% ± 2%) of the RGC. Cell death was prevented by MK-801 (10 μmol/L), APV (100 μmol/L) and Memantine (100 μmol/L) with a increasing the cell viability of (96% ± 4%) (P < 0.001), (80% ± 5%, P= 0.010) and (76% ± 9%,P =0.144), respectively. (2) BzATP (50 μmol/L) led to a large, sustained increases of intracellular Ca2+ (1183 ± 109) nmol/L. Calcium influx triggered by BzATP was attenuated by pre- and co-incubation of MK-801 (10 μmol/L), APV (300 μmol/L) and Memantine (30 μmol/L) with (76% ± 7%,P =0.003), (51 %± 17%,P =0.033) and (55% ± 16%,P =0.025), respectively. 【Conclusions】 Stimulation of P2X7 receptor leads RGC to death may upstream act on NMDA receptors. It implicates that both P2X7 and NMDA receptor are in excitotoxic death of RGC.
青光眼高眼压最终导致视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGC）凋亡。兴奋性神经毒谷氨酸（Glutamate）升高、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体激活是引起RGC凋亡的重要原因［1］。前期研究已证实高眼压 [2,3]可引起嘌呤信号ATP释放，激活嘌呤受体P2X7导致RGC细胞内钙离子（Ca2+）浓度升高[4-7]、细胞凋亡[4]和RGC释放出谷氨酸[7]。为进一步探讨P2X7与NMDA受体在介导RGC凋亡机制中的相互作用关系，本文进行了如下研究。
1 材料与方法
1.1 RGC标记及RGC体外培养
购买怀孕Long-Evan大鼠（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）饲养，取生后第4～6天新生鼠，按本实验室成熟的技术[6]，从上丘注射荧光染料Aminostilbamidine（Molecular Probes, Eugene, OR），逆行标记RGC。注射后2~8 d内将动物给予过量麻醉药处死幼鼠，摘取眼球，分离视网膜，按RGC体外培养方法[6]获得RGC细胞悬液，进行24 h培养。
1.2 RGC细胞存活率的测定
取5只来自不同母鼠的幼鼠进行P2X7与NMDA受体相互作用的实验。将每个培养板内的12个盖玻片分为3组，每组4孔：4孔为对照组，不含任何药物；4孔含P2X7受体激动剂BzATP（50 μmol/L）；4孔先加入NMDA受体通道拮抗剂MK-801（10 μmol/L）或APV（100 μmol/L）或Memantine（100 μmol/L），在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养30 min，进行预处理，然后加入BzATP（50 μmol/L）。最佳浓度由预实验获得。加药后培养板置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h，然后将盖玻片取出，置于荧光显微镜（Nikon Eclipse E600）下，计数荧光标记的RGC。存活的RGC细胞胞体发绿色荧光，胞浆内含发黄绿色强荧光的不规则颗粒。在40×高倍显微镜下计数80个视野内存活的RGC。细胞计数由固定的实验人员完成。计数时采用单盲法：计数前由另一实验员将盖玻片进行随机编号，计数人员对所计数玻片的处理不知情。
1.3 RGC胞内Ca2+浓度的测定
同前法培养RGC[6]，但RGC事先不用荧光染料标记。细胞内Ca2+浓度测定：细胞培养24 h后，加入10 μmol/L 钙离子荧光标记物Fura-2 和200 mg/L pluoronic（Molecular Probes，Eugene, Oregon），室温下孵育60 min。将盖玻片取出置于Ca2+测定影像仪上（PTI, Photon Technologies International, Inc., Lawrenceville, NJ），进行单个RGC胞内Ca2+浓度的测定。获取Ca2+ 影像时，盖玻片分别用340 nm和380 nm光源激发，选定的视野内（RGC所在区域）> 520 nm的发射光被系统捕获。Ca2+浓度由340 nm和380 nm激发下测定的荧光强度的比率换算而得（配套软件ImagMaster and Flix software, PTI, Inc.）。灌注液（pH 7.4）含105 mmol/L NaCl, 4.5 mmol/L KCl, 2.8 mmol/L Na-Hepes, 7.2 mmol/L Hepes acid, 1.3 mmol/L CaCl2, 0.5 mmol/L MgCl2, 5 mmol/L Glucose, 75 mmol/L Mannitol。校正液（pH 8.0）含5 μmol/L ionomycin 和5 mol/L EGTA。所有实验均在室温下进行。被检测的RGC取自4只来源于不同母鼠的幼鼠。
进行单独BzATP实验时，每次加入BzATP（50 μmol/L）15 s，之间用灌注液冲洗6 min，在同一细胞上重复4次，获取可重复性的波峰；进行NMDA拮抗剂阻断BzATP作用实验时， 分别用三种不同拮抗剂MK-801（10 μmol/L）、APV（300 μmol/L）和Memantine（30 μmol/L），最佳浓度亦由预实验获得。加入BzATP（50 μmol/L）15 s后，用灌注液冲洗3 min，接着分别加入三种不同拮抗剂3 min 。后再给予BzATP（50 μmol/L）15 s。在同一细胞上实验重复2次，获取可重复性的波峰。
1.4 数据处理
数据表达为平均值±标准误。采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理和分析。应用独立样本t检验检测组间差异。对于细胞活性实验研究，实验次数（n）表示每次数80个视野的载玻片个数。因每次实验获取RGC浓度不同，每次RGC计数结果先经标准化再列入统计学分析：每个载玻片中RGC的百分比=（80个视野的RGC总数/当次实验对照组RGC数的平均值）×100%。对Ca2+ 影像测定, n为测定的细胞个数。设定P< 0.05为具有统计学差异。
2 结 果
2.1 NMDA受体拮抗剂阻断P2X7受体激动剂BzATP介导的RGC胞内Ca2+升高作用
P2X7受体激动剂BzATP可引起RGC胞内Ca2+显著升高 [4,6]。本研究应用50 μmol/L BzATP 作用15 s，RGC胞内Ca2+ 最大可升高至（1183 ± 109）nmol/L。移除BzATP后，用灌注液冲洗6 min，待胞内Ca2+浓度稳定后给予第2次刺激，胞内Ca2+又升高，重复3～4次得到可重复均一波峰，BzATP反应的平均峰值为（904 ± 95）nmol/L （n = 8，图1A）。
NMDA受体拮抗剂可阻断BzATP介导的Ca2+ 升高：分别用三种不同拮抗剂MK-801（10 μmol/L）、APV（300 μmol/L）和Memantine（30 μmol/L）进行实验。如先用BzATP（50 μmol/L）15 s后，得到第一个RGC胞内Ca2+ 升高的波峰，峰值为（468±154）nmol/L，用灌注液冲洗3 min，接着MK-801（10 μmol/L）预处理3 min后，给予50 μmol/L BzATP刺激15 s，得到第２个RGC胞内Ca2+ 升高的波峰，峰值为（69 ± 13）nmol/L。为了更客观地观察MK-801的作用，在同一细胞再重复上述实验，分别得到第３和第４个波峰，峰值分别为（296 ± 89）nmol/L、（72 ± 22）nmol/L（图1B）。将图1B中两次MK-801作用下BzATP的反应高峰的平均值（70 ± 12）nmol/L与两次单独BzATP刺激的反应高峰的平均值（382 ± 117）nmol/L进行比较，MK-801（10 μmol/L）可显著降低BzATP介导的Ca2+升高幅度达（76% ± 7%，n =4, t=4.739, P =0.003）。 同法进行APV（300 μmol/L）和Memantine（30 μmol/L）的实验，得到图1C和1D，两者分别降低BzATP介导的Ca2+升高幅度为（51% ± 17%，n =4, t=2.760, P=0.033）、（55% ± 16%，n =11, t=2.436, P=0.025）。三组数据均表明NMDA受体拮抗剂可阻断BzATP介导的Ca2+ 升高。
2.2 NMDA受体拮抗剂减少P2X7受体激活剂BzATP介导的RGC凋亡
对事先用荧光染料Aminostilbamidine标记的幼鼠RGC进行原代培养。已知与50 μmol/L BzATP共同孵育24 h 后，RGC数量较正常对照组明显减少（图2A、B），呈剂量依赖性，且细胞以凋亡形式死亡。 本实验50 μmol/L BzATP组RGC的数量为对照组的(64% ± 2%)。事先分别用NMDA受体通道拮抗剂MK-801（10 μmol/L）、APV（100 μmol/L）和Memantine（100 μmol/L）孵育30 min，再与BzATP共同孵育24 h。MK-801（10 μmol/L）和APV（100 μmol/L） 使BzATP诱导的RGC凋亡数目大大减少, 存活率上升，但Memantine（100 μmol/L）的作用较弱（图3）。
3 讨 论
3.1 嘌呤研究的进展
嘌呤和嘌呤受体是重要的调节递质影响着中枢和周围神经系统功能［4］, 近年来成为神经领域研究的热点之一。
嘌呤家族分为P1、P2两大类。P1代表着以腺苷（Adenosine）及其A1、A2A、A2B和A3受体的一类核苷；P2家族包括ATP及其核苷酸受体P2X1-7和P2Y1-6，其中，P2X7受体是近年来发现的、有独特特点的受体，在钙离子(Ca2+)内流、细胞凋亡等方面起重要作用[5-10]。研究表明哺乳类及鼠视网膜神经元含有P2X1-7的受体表达，尤其RGC层有P2X7的存在[11]。近年来研究发现P2X7受体的激活参与了大量视网膜疾病的发生、[12-14]。例如在玻璃体视网膜病变中，P2X7受体的表达增加[12]；受体的激活可引起视网膜周细胞收缩[14]。
我们已有的研究阐明了ATP受体P2X7激活是导致RGC凋亡的重要环节[5-8]，提出青光眼视神经损伤嘌呤调节的可能机制：青光眼高眼压引起嘌呤信号ATP释放[2-3]，作用于视网膜细胞上P2X7受体，引起Ca2+内流导致RGC凋亡[5]。将嘌呤调节引入青光眼中研究，为探讨青光眼发病机制提供了新的思路与途径。
3.2 NMDA与青光眼发病机制
青光眼是由病理性高眼压引起，以RGC死亡、视功能逐渐丧失为主要特征的一种进行性视神经病变。RGC以凋亡的形式死亡，但目前RGC凋亡的机制尚未完全清楚。
有学说认为升高的眼内压可能降低了视神经乳头的血流灌注，但在没有眼内压升高的视网膜动脉阻塞的病例中，却没有见到在青光眼中应见到的同样改变，表明在正常的血管弹性下，单纯血管因素是不足以引起RGC死亡的；另有人认为，升高的眼内压也可能因为扩张了视神经乳头筛板从而抑制了神经营养因子诸如脑源性BNDF等的轴浆运输，但研究发现RGC的死亡可以先于神经营养因子的缺乏，这表明RGC的死亡在早期可能胞体早有变化，后因神经营养因子的缺乏而加速了死亡进程。另一理论涉及的是兴奋性神经毒损伤：兴奋性神经毒谷氨酸（Glutamate）升高、NMDA受体激活引起RGC细胞内Ca2+升高导致细胞死亡[1]。尽管目前对此学说仍未完全肯定[15，16]，但可重复性的研究证实谷氨酸受体激动剂确实对RGC表现出毒性作用[1，17，18]。临床和基础研究表明谷氨酸受体NMDA拮抗剂Memantine能预防压力诱导的RGC死亡，提示谷氨酸在青光眼发生发展中起一定作用[19]。然而，升高的眼内压是如何产生过量的谷氨酸去过激NMDA受体还不完全清楚，最初有研究报道，降低谷氨酸转运子水平并不能逆转这一作用[19，20]。
3.3 P2X7受体/NMDA受体在青光眼发病机制中的作用
研究已表明，嘌呤信号转导在高眼压致谷氨酸增高的过程中起重要中介调节作用。首先高眼压可引起ATP释放。实验发现，压力、损伤、应激等均可刺激嘌呤信号ATP的释放[2，3, 22，23]，如轻度的压力可导致内层视网膜星状细胞释放出ATP[22],眼内压升高可检测到视网膜持续的释放出ATP[2，3]。我们将剪去眼前段的新鲜牛眼放入自制压力容器中，牛眼杯内ATP浓度随压力升高而增高[2]。另外，在激光诱导的实验性猴青光眼模型中检测到玻璃体腔ATP水平的增高[2]。最近在临床高眼压青光眼病人房水中也证实有ATP释放（数据待发表）。
ATP受体P2X7激活可导致RGC凋亡 [1-3，5-8]。关键的研究显示P2X7受体激活可诱发出视网膜星状细胞[25]和RGC[8]释放出谷氨酸（Glutamate）。因此，眼内压力、P2X7受体、谷氨酸释放及NMDA受体之间可能存在一定的相互作用，而明确其相互作用机制可能是理解RGC死亡和保护的关键部分。
本研究结果显示，三种NMDA受体拮抗剂MK-801、APV和Memantine均可阻断P2X7受体激动剂BzATP介导的RGC胞内Ca2+升高作用和减少体外培养的BzATP介导的RGC死亡数量。有力地说明，P2X7与NMDA受体之间可能共同介导着RGC兴奋性神经毒损伤机制，且P2X7在NMDA受体的上一环节先起作用。
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