应用磷酸钙骨水泥对家兔TNF-α及IL-6表达的影响
作者：许忠玲，季玉红，黄雪莲，高永涛
【摘要】 目的：探讨植入骨水泥不同时期对白细胞介素6（IL-6），肿瘤坏死因子α（TNF-α）应激反应蛋白表达的影响。方法：建立家兔骨水泥型人工全髋关节置换手术模型，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测手术前、中、后不同时期家兔血清中IL-6及TNF-α的表达水平。结果：骨水泥型人工全髋关节置换术中，扩髓后家兔血清中TNF-α表达与对照组（术前）相比略有上调。至手术结束时到手术后24h，血清中TNF-α，IL-6与对照组相比有显著升高。结论：骨水泥植入后，家兔血清内IL-6, TNF-α 浓度呈时间依赖性的表达改变。提示CPC植入可能影响免疫应答反应。
【关键词】 磷酸钙骨水泥；肿瘤坏死因子α；白细胞介素-6；家兔
Effect of calcium phosphate cement on TNF-α and IL-6 expression in rabbits
[Abstract] Objective: To investigate the effect of calcium phosphate cement (CPC) on IL-6 and TNF-α expression in rabbits. Methods: Models of hip arthroplasty were prepared in rabbits. ELISA was used to detect the expression of IL-6 and TNF-α at various times after implantation of bone cement. Results: Slight up-regulation of TNF-α expression was detected at the time of reaming as compared with the control, while rapid increase of both TNF-α and IL-6 was observed from the end of surgery to 24h post-surgery. Conclusion: Implantation of CPC induced temporal expression of IL-6 and TNF-α in rabbit serum, indicating a possible role of CPC in evoking the immune response.
[Key words] Calcium phosphate cement；Tumor necrosis factor α；Interleukin-6；Rabbit
应激反应指的是机体创伤后内分泌及代谢变化。在全髋置换术中，患者存在着免疫调节功能的异常。异常的免疫调节功能与手术创伤的应激和细胞因子平衡相关[1]。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement, CPC),亦称羟磷灰石骨水泥(hydroxy apatitece-ment，HAC)，是80年代中期由Brown和Chow研制出来的一种新型自固化型人工骨替代材料。有关CPC研究的大量报道表明,从CPC植入体内到降解过程中，所产生的颗粒碎片可影响细胞的生物学功能[2]。本研究拟通过动物实验和临床实验，研究应用骨水泥后不同时期对白细胞介素6（interleukin 6，IL-6），肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等应激反应蛋白的表达,为预防骨水泥对神经免疫内分泌等应激反应影响、改善预后提供依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 选择3～5月龄左右的健康家兔20只作为实验对象，体重2.0～3.0 kg，雌雄各半，由南通大学实验动物中心提供。
1.2 手术方法 常规用9%硫化钠脱毛麻醉消毒后，俯卧位固定家兔。由于兔存在有第三转子这个特殊的解剖结构，我们采用髋后外方入路。以左侧股骨第三转子为中心标志，做长约4 cm弧形切口,从股骨后外方肌间隙进入，暴露第三转子、大转子及后方的转子间窝，在第三转子上方纵行切开骨膜并分离，用自制骨锯横行将大转子外侧部分切除,用自制的探针在转子间窝找到骨髓腔入口，用自制的扩凝器反复扩髓后(深度为兔股骨长度的1/2)，用装满生理盐水注射液的10 ml一次性针管连接16#长针头，伸入骨髓腔内反复冲洗创面，纱布条沾干。按粉、液比2∶1比例调配骨水泥,持续手工搅拌,待聚合至面团状态后使用。为避免CPC填入股骨骨髓腔后深度无法控制，首先将一小块面团状CPC作成髓腔大小塞状物，用器械轻轻填入髓腔内至股骨中段狭窄处,作为髓腔塞，待10 min CPC基本固化后，再将重新调配好呈面团状CPC用器械填入股骨骨髓腔内，直至填满为止。待CPC完全固化后，彻底止血，用生理盐水注射液反复冲洗伤口内，沾干，放入庆大霉素注射液1 ml和青霉素钠40万U，逐层缝合,闭合创口。
1.3 TNF-α及IL-6检测方法 根据取血时间的差异将家兔分为术前(T1)﹑扩髓即刻(T2)、置入骨水泥即刻(T3)、术毕(T4)、术后24h(T5)等5组。从左侧颈内静脉抽血2 m1，即刻离心，分离血清，采用双抗夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清中TNF-α及IL-6表达水平。
1.4 统计学方法 各实验组设实验动物4只，每次实验重复3次。以术前(T1)测得值为对照（设其值为1），将各组所得数据标准化。运用Stata 7.0统计分析软件，进行单因素方差分析，检验水准设为0.05。
2 结 果
2.1 骨水泥植入前后，家兔血清TNF-α表达的变化 如图1所示，骨水泥型人工全髋关节置换术后，TNF-α的表达水平随时间的推移呈动态改变。于扩髓即刻（T2）与置入骨水泥即刻（T3）检测到TNF-α表达比对照组(T1)略有上调（2.175±0.178，2.603±0.382，P<0.05）。于手术结束时(T4)和术后24h(T5)检测到TNF-α表达比对照组明显升高（6.775±1.102，8.425±0.542，P<0.01）
2.2 骨水泥植入前后，家兔血清IL-6表达的变化 如图2所示，与TNF-α表达的动态改变相似，骨水泥型人工全髋关节置换术后，兔血清中IL-6的表达水平亦随时间的推移而改变。扩髓即刻（T2）与置入骨水泥即刻（T3）未检测到IL-6表达与对照组（T1）有明显差异。于手术结束时(T4)和术后24h检测到IL-6表达比对照组明显升高（4.855±0.216，5.391±0.484，P<0.01）。
3 讨 论
手术和创伤后可引起炎性反应并且导致全身的应激反应,出现神经内分泌系统免疫调节的变化，表现为下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴和交感神经肾上腺髓质系统的兴奋；外周血中淋巴细胞亚群的改变以及血浆中激素，如生长激素、糖皮质激素、甲状腺素和细胞因子浓度IL-2、IL-10等表达变化等。
人工全髋关节置换手术的特点是手术创伤大、失血多，手术中需应用骨水泥并可能会出现心血管不良反应。据SOLVD多中心大规模临床实验表明, 应激反应蛋白TNF-α和IL-6的血浓度升高与心功能恶化相关,TNF-α与患者的生存率有关。证明炎症细胞因子的过度表达是促进患者从无症状至有症状心衰进展的生物学机制之一。
在全髋置换术中，患者存在着免疫调节功能的异常。目前的研究普遍支持骨水泥颗粒可诱导巨噬细胞中IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子的表达[3]。亦有实验证实细胞因子参与创伤后下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的激活，促成应激后组织和器官的功能变化。本研究表明骨水泥植入后IL-6，TNF-α呈时间依赖性的表达改变。IL-6，TNF-α的表达上调很可能与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的激活以及继发的组织功能改变相关，这提示在全髋置换术中，细胞因子IL-6和TNF-α很可能通过神经内分泌网络中发挥免疫调节作用。进一步明确人工全髋关节置换术后骨水泥诱导IL-6、TNF-α等应激因子表达的机制，将有利于建立对骨水泥应激反应影响的预防措施、术中相应的处理方案，大大降低骨水泥的死亡率,提高骨水泥型人工假体置换的成功率。
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