Myostatin干扰质粒的构建及在C2C12细胞中的效果验证

                      作者：吴欣，邵晨昕，顾芸，丁斐，刘梅 

【摘要】  目的：研究Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。方法：根据Myostatin mRNA序列，选择3个19nts的靶序列，设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链以及1个无干扰作用DNA链，退火后插入pSilencer2.1-U6表达载体，构建3个RNAi阳性质粒：M1/pSilencer、M2/pSilencer、M3/pSilencer及一个阴性质粒Mc/ pSilencer并转染C2C12细胞，采用实时荧光定量PCR和Western blot观察RNAi对C2C12细胞中Myostatin mRNA和蛋白表达的下调作用。结果：构建的3个阳性干扰质粒中M1/pSilencer能显著降低C2C12细胞中Myostatin表达量，随着M1/pSilencer干扰质粒剂量的增加，Myostatin表达量逐渐降低。结论：成功构建Myostatin RNAi质粒，该质粒能下调目的基因Myostatin在C2C12细胞中的表达量。

【关键词】  Myostatin；RNA干扰；C2C12

    [Abstract]   Objective：To evaluate the role of RNA interference (RNAi) in silencing Myostatin expression in mouse C2C12 cells (myoblast). Methods：Three target sequences and a negative sequence were selected according to Myostatin mRNA sequence，the complementary DNA contained both sense and antisense oligonueleotides were designed and synthesized．After annealing, the double strands DNA were ligated to the pSilencer2.1-U6 siRNA expression vector．Three positive RNAi plasmids named M1/pSilencer, M2/pSilencer, M3/pSilencer, and the nagetive plasmid named Mc/pSilencer were transfected into the C2C12 cells, in which the silencing effect on Myostatin expression was investigated by real-time PCR and Western blot. Results：Among the three RNAi positive plasmids, the M1/pSilencer could reduce Myostatin expression significantly. With the dose of plasmid M1/pSilencer increasing, the expression of Myostatin and mRNA decreased. Conclusion：The results indicated that Myostatin RNAi plasmids were obtained, and the RNAi plasmids could reduce Myostatin expression in C2C12 cells.

    [Key words]   Myostatin；RNAi；C2C12

    1997年美国Johns Hopkins大学的研究人员从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆出Myostatin。蛋白质同源性比较证明Myostatin是TGF-β超家族的新成员，又称生长分化因子8。在Myostatin敲除的小鼠体内，肌纤维发生广泛的增生和肥大，导致骨骼肌肌肉质量显著增加[1~4]。Myostatin编码序列发生突变的牛也出现肌肉质量显著增加，呈现“双肌现象”[5，6]。由此可见，Myostatin能抑制骨骼肌的生长，是骨骼肌生长的负性调控因子[3，7]。我们以前的研究表明，在坐骨神经缺损后，失神经支配的腓肠肌Myostatin mRNA和蛋白具有特定的表达模式[8，9]，提示Myostatin在失神经性肌萎缩过程中扮演重要角色。为了进一步探讨Myostatin在失神经肌萎缩中的生物学作用，本实验构建小鼠Myostatin RNAi质粒，采用Western Blot及荧光定量PCR法，验证Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。

    1   材料和方法

    1.1   细胞及主要试剂   C2C12细胞株，购自北京军事医学院。DMEM，Lipofectamin 2000（Invitrogen），胰蛋白酶（Sigma），胎牛血清（杭州四季青有限公司），pSilencer2.1-U6表达载体（Ambion公司），限制性内切酶BamHⅠ，Hind Ⅲ（TaKaRa公司），细胞蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒（上海申能博采生物科技有限公司），兔抗小鼠Myostatin多抗（Chemicon），IRDye 800偶联的驴抗兔及驴抗羊IgG（H&L,Rockland, USA），羊抗小鼠GAPDH多抗（Santa Crus）。

    1.2   C2C12细胞的培养   C2C12细胞接种于含DMEM完全培养基（10％胎牛血清）的培养皿中，置于5％CO2、饱和湿度、37℃培养箱内培养。2天换液1次。实验所用的细胞均处于对数生长期。

    1.3   Myostatin RNAi质粒构建   根据小鼠Myostatin mRNA序列（注册号为NM_010834）获得3对来自Ambion公司的siRNA序列信息，按ID# 156380的序列，将碱基序列重排，经GenBank BLAST检索，不与小鼠任何基因同源，作为阴性对照的序列（表1），根据发夹siRNA的构成方式，设计siRNA模板，包含各正反义靶序列的互补DNA链、限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ 识别序列（表2），上述4对RNAi序列由上海鼎安生物科技有限公司合成。用TE溶解siRNA模板寡核苷酸，浓度至1 μg/μl。 SiRNA模板核苷酸的退火：反应在灭菌的0.5 ml离心管中进行，依次加入：sense siRNA模板核苷酸2 μl， antisense siRNA 模板核苷酸2 μl， 2×DNA Annealing Solution 25 μl，反应总体系50 μl，轻轻混匀，稍加离心。90℃ 3 min后，37℃ 1 h，退火的siRNA模板链-20℃保存备用。将5 μl模板链加入45 μl双蒸水中，终浓度为8 ng/μl。

    模板链与pSilencer2.1-U6载体的连接，依次加入：10×连接酶缓冲液1 μl，载体1 μl， 模板链1 μl，T4 DNA连接酶1 μl。反应总体系10 μl，轻轻混匀，稍加离心。4℃，过夜。连接产物的转化，重组质粒的筛选，抽提，测序证实后测定A260，对质粒进行定量，-20℃保存备用。

    1.4   Myostatin RNAi质粒转染C2C12细胞   细胞处理：转染前24 h将培养的C2C12细胞以0.25％胰蛋白酶消化，用不含抗生素的DMEM完培终止反应，接种于24孔培养板，使转染当天细胞融合达80%~85％。转染：四个质粒均根据lipofectamin 2000操作说明，按照1 μg质粒和2 μl lipofectamin 2000/孔进行转染。4~6小时后换生长培养基（DMEM＋10％胎牛血清）。24小时后扩至6孔培养板，继续培养至72小时，收获细胞。

    1.5   实时荧光定量PCR检测成肌细胞系C2C12中myostatin mRNA表达的变化   转染72h后Trizol法提取C2C12总RNA，RT-PCR合成第一链，将1μl cDNA模板加入19 μl 定量PCR反应液（含1×PCR Buffer、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、Myostatin或GAPDH上下游引物各0.5 μmol/L、Myostatin或GAPDH荧光探针各0.3 μmol/L、 Taq DNA 聚合酶1 U），混匀后加入专用离心管中，并设空白管、阴性对照和Myostatin或GAPDH各5个标准品对照（浓度分别为105、104、103、102、101 pg/ml）。各反应管于荧光定量PCR仪进行扩增：94℃预变性2 min，然后94℃ 20 s，60℃ 60 s，共40个循环。根据各自标准品建立的标准曲线，由软件自动出待测样本中Myostatin或GAPDH的准确含量。为了消除样本、逆转录和PCR反应的差异，以 Myostatin mRNA和GAPDH mRNA含量的比值作为评价Myostatin表达水平的指标。相同实验重复4次。

    1.6   Western-Blot检测成肌细胞系C2C12中myostatin表达的变化   转染72h后总蛋白提取及蛋白浓度测定: 移去培养基，以预冷的0.01M PBS漂洗一遍。移去PBS，加入细胞蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂提取总蛋白。采用BCA法测定总蛋白浓度。12%SDS-PAGE电泳，采用半干转移至PVDF膜，封闭后，分别采用兔抗鼠myostatin单克隆抗体（1∶500）或山羊抗鼠GAPDH单克隆抗体（1∶300），一抗,4℃过夜。相应二抗为IRDye 800偶联的驴抗兔IgG，IRDye 800偶联的驴抗羊IgG，显色后，Odyssey Infrared Imaging System（Rockland，USA）进行灰度扫描，PDQuest 7.2.0软件分析结果。以myostatin和GAPDH扫描灰度的比值作为评价myostatin蛋白水平的指标，相同实验重复4次。

    1.7   统计学方法   应用STATA7.0统计分析软件对样本数据进行t检验，并分别计算均数（x）和标准差（s），所得结果表示为x±s，显著性差异的概率设为P<0.05。

    2   结      果

    2.1   双链siRNA构建   退火后形成的双链siRNA，产物经电泳鉴定，条带位置与预期扩增长度相符，分子量66 bp左右。

    2.2   siRNA重组质粒酶切鉴定   4对siRNA模板链与pSilencer2.1-U6载体的连接，转化DH5α感受态细胞，从而获得重组质粒，3个阳性质粒分别命名为M1/pSilencer、M2/pSilencer、M3/pSilencer，阴性对照质粒命名为 Mc/pSilencer，在BamH I、 Hind Ⅲ酶切得到66 bp，证实有双链siRNA的插入。经测序证实与原序列相符。

    2.3   转染后C2C12细胞Myostatin的表达   Western Blot检测转染不同Myostatin干扰质粒后C2C12细胞Myostatin 蛋白含量，结果见图1。结果显示，与阴性质粒对比， M1/pSilencer质粒能显著减少C2C12细胞Myostatin 蛋白表达(P<0.05)。

    2.4   转染不同剂量干扰质粒C2C12细胞Myostatin mRNA及其蛋白的表达变化   实时荧光定量PCR和Western Blot检测转染不同剂量（0.4 μg、1.0 μg、 2.5 μg）M1/pSilencer质粒后，C2C12细胞中Myostatin mRNA和蛋白含量，结果见图2、3。结果表明，M1/pSilencer干扰质粒对C2C12细胞Myostatin的表达具有沉默作用，该作用存在着剂量效应关系，随着其剂量的增加，下调C2C12细胞Myostatin mRNA和蛋白表达作用越明显。

    3   讨      论

    C2C12细胞是小鼠成肌细胞系，在一定的条件下可诱导分化为骨骼肌细胞，是一种较好的用于研究肌细胞增殖及分化有关因子的模型。本研究采用RNA干扰技术构建Myostatin 干扰质粒，并观察其在C2C12细胞中抑制靶基因Myostatin的表达效果。

    以往研究表明，Myostatin是肌肉生长的负性调控因子，可通过抑制成肌细胞的增殖而发挥作用，该基因的突变或缺失可导致肌肉质量的显著增加，而其表达上调则可抑制肌肉蛋白质的合成，导致肌肉质量的丢失。我们前期的研究发现，Myostatin在失神经所致的肌萎缩过程中发挥着重要的生物学作用。为进一步探讨抑制Myostatin表达是否能延缓失神经肌萎缩，我们合成小鼠Myostatin干扰序列，构建RNA干扰质粒，转染C2C12细胞，观察其抑制或沉默Myostatin表达效果。

    目前有多种制备siRNA的方法，如化学合成法[10]、体外转录法[11]、长链dsRNA的RNaseⅢ家族体外消化法[12，13]、siRNA表达载体法[14，15]、siRNA表达框架法[16]等。本研究采用siRNA表达载体法，将siRNA对应的siDNA序列克隆到适当的启动子和转录终止信号之间形成siRNA表达载体，通过脂质体导入C2C12细胞后，利用胞内的RNA聚合酶转录产生siRNA[17]，进而抑制或沉默Myostatin的表达，并采用实时荧光定量PCR和Western Blot方法，在细胞水平验证干扰序列对小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞Myostatin的沉默作用。该方法有较强的特异性，易于操作，便于在细胞水平观察沉默效果。

    本研究结果表明，制备的3个小鼠Myostatin RNAi阳性质粒M1/pSilencer，M2/pSilencer和M3/pSilencer中M1/pSilencer有干扰效果，可显著下调C2C12细胞中Myostatin及其mRNA的表达，且随着转染干扰质粒量增加，其下调作用越明显，呈一定的量效关系。本研究为进一步通过动物体内实验采用RNA干扰技术探讨Myostatin在失神经肌萎缩过程中的生物学作用提供实验基础。

【】
  [1] Miyazono K, Kusanagi K, Inoue H. Divergence and convergence of TGF-beta/BMP signaling[J]. J Cell Physiol,2001, 187（3）: 265-276.

[2] McPherron AC, Lawker AM, Lee SJ, et al. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-β superfamily member[J]. Nature, 1997, 387(6628): 87-90.

[3] Westhusin M. From mighty mice to mighty cows[J]. Nat Genet,1997, 17(1):4-5.

[4] Lee SJ, McPherron AC, et al. Myostatin and the control of skeletal muscle mass[J]. Curr Opin Genet Dev, 1999,9(5): 604-607.

[5] Lee SJ, McPherron AC. Regulation of myostatin activity and muscle growth[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(16): 9306-9311.

[6] McPherron AC, Lee SJ. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(23): 12457 -12461.

[7] Grobet L, Martin LJ, Poncelet D, et al. A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle[J]. Nat Genet, 1997, 17(1): 71-74.

[8] 邵晨昕, 吴 欣, 刘 梅，等. Myostatin在小鼠腓肠肌失神经支配萎缩过程中的表达[J]. 解剖学杂志，2006, 29(2): 146-149.

[9] Zhang DL, Liu M, Ding F, et al. Expression of myostatin RNA transcript and protein in gastrocnemius muscle of rats after sciatic nerve resection[J]. J Muscle Res Cell Motil,2006,27(1):37-44.

[10] Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21- nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature, 2001,411（6836）:494-498.

[11] Donze O, Picard D. RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase[J]. Nucl Acid Res, 2002, 30(10): e46.

[12] Myers JW, Jones JT, Meyer T, et a1. Recombinant dicer effciently converts large dsRNAs into siRNAs suitable for gene silencing[J]. Nat Biotech, 2003, 21（3）: 324-328.

[13] Yang D, Buchholz F, Huang ZD, et a1. Short RNA duplexes produced by hydrolysis with Escherichia coli RNase III mediated effective RNA interference in mammalian cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(15): 9942-9947.

[14] Miyagishi M, Taira K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3’overhangs efficiently suppress target gene expression in mammalian cells[J]. Nat Biotech, 2002, 20（5）: 497-500.

[15] Paul CP，Good PD，Winer I, et a1. Effective expression of small interfering RNA in human cells[J]. Nat Biotech, 2002, 20（5）: 505-508.

[16] Castanotto D, Li H, Rossi JJ, et al. Functional siRNA expression from transfected PCR products[J]. RNA, 2002, 8（11）: 1454-1460.

[17] Shinagawa T, Ishii S. Generation of Ski-knockdown mice by expressing along double-strand RNA from an RNA polymerase II promoter[J]. Genes Devel, 2003, 17（11）: 1340-1345.