细胞骨架蛋白肌球蛋白轻链与癌蛋白TRE17相互作用的鉴定
作者：杨永刚，田 田，郭 丹，武慧娟，王露，徐宁，沈传陆
【摘要】 目的：探讨MLC2与TRE17之间的相互作用。方法：构建了MLC2原核表达质粒，在用pGEX蛋白表达系统表达和纯化GST-MLC2和GST蛋白后，用GST Pulldwon方法进一步观察MLC2与TRE17之间的相互作用。结果：限制性内切酶分析和DNA序列测定表明MLC2 cDNA完整ORF以正确的阅读框架插入pGEX-6P-1载体；IPTG诱导表达的GST-MLC2和GST蛋白纯度在90%以上；GST Pulldown分析表明癌蛋白TRE17(447)结合GST-MLC2融合蛋白，而不是对照GST蛋白。结论：MLC2是TRE17的特异性结合蛋白。
【关键词】 癌基因；肌球蛋白轻链；蛋白质相互作用
[Abstract] Objective: To identify interaction of cytoskeletal MLC2 with oncogene TRE17. Methods: Plasmid GST-MLC2/pGEX was constructed in this study and used to express GST-MLC2 fusion protein. After purification of GST-MLC2 and GST proteins, MLC2 interaction with TRE17 was tested by GST pulldown assay. Results: The MLC2 cDNA was inserted into pGEX-6P-1 vector with correct open reading frame. After expression and purification of GST-MLC2 and GST proteins, GST pulldown assay suggested the association of TRE17(447) with MLC2, not GST protein. Conclusion: Skeletal MLC2 might be a binding partner of TRE17 oncoprotein.
[Key words] Oncogene; Myosin light chain; Protein interaction与动物细胞相比，人类正常细胞难以恶性转化为肿瘤细胞[1，2]。其原因除与人类细胞的端粒长度较短和Ras/Erk信号途径异常复杂相关外，可能还与人类细胞的肌动蛋白细胞骨架的稳定性有关[3]。MLC2是调节性肌球蛋白轻链（myosin regulatory light chain， MLC）。通过刺激肌球蛋白头部ATP酶活性和增强肌动蛋白与肌球蛋白相互作用，磷酸化的MLC2能调节肌动蛋白细胞骨架的稳定性[4，5]。我们曾用酵母双杂交技术发现MLC2可能是TRE17的结合蛋白[6]，但鉴于用酵母双杂交系统筛选靶蛋白存在假阳性问题，因此，本文用GST Pulldown方法研究了TRE17与MLC2之间的相互作用，为进一步探讨TRE17诱导细胞恶性转化中的细胞骨架调节机制打下基础。
1 材料和方法
1.1 细胞培养 HeLa细胞被置于含10%小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/L青霉素和100 μg/L链霉素的DMEM（高糖）培养基中，于5% CO2、37°C培养。待细胞于2～3天基本融合，用0.125%胰蛋白酶/0.5% EDTA混合液消化，按1∶3～1∶4传代培养。
1.2 MLC2原核表达质粒的构建和蛋白表达 在用RNAiso试剂（TaKaRa公司）制备细胞总RNA后，用上游引物（5’-CCGGATCCATGTCGAGCAAAAG-3’）和下游引物: 5’-AAGAATTCTCAGTCATCTTTGT-CTTTGG-3’）进行RT-PCR，扩增出人MLC2 cDNA完整开放读码框架（open reading frame, ORF）。该RT-PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切后，与经同样酶切的pGEX-6P-1载体连接， 生成GST-MLC2融合蛋白原核表达质粒GST-MLC2/pGEX。大肠杆菌BL21被该质粒转化后，GST-MLC2蛋白经适当浓度IPTG诱导表达和在非变性条件下经谷胱甘肽Sepharose 4B （Amersham）纯化后，用于下列GST Pulldown分析试验。
1.3 GST Pulldown分析 用LipofectamineTM 2000(Invitrogen)
法将HA-TRE17（447）/pcDNA转染HeLa细胞4～5 h。换新鲜培养基继续培养20～24 h后，加入细胞裂解液（0.1% NP-40、20 mmol/L Tris-HC1（pH8.0）、150 mM KCl、2 mM EDTA、5 mM DTT、10%(v/v)甘油、蛋白酶抑制剂)，收取细胞裂解物。离心后留取上清液40 ?滋l作对照(WCL)，将其余上清液均分为两份，分别加入纯化的10 μl GST和GST-MLC2树脂，于4°C持续混匀约4 h后，4°C，14 000 r/min离心2 min。洗去未结合的蛋白质，加入样品缓冲液，煮沸变性，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜。用抗HA单克隆抗体及HRP标记的二抗检测融合蛋白HA-TRE17（447），然后与增强型化学发光底物反应5 min。在暗室内压上X光片，曝光适当时间，进行显影和定影，以显示各蛋白条带。
2 结 果
2.1 MLC2原核表达质粒的构建与鉴定 经BamH I和EcoR I双酶切的MCL2 cDNA完整ORF与经同样酶切的原核表达载体pGEX-6P-1连接，生成GST-MLC2融合蛋白原核表达质粒GST-MLC2/pGEX。该质粒经BamH I+EcoR I双酶切时出现525bp长的特征性的片段（图1）。DNA序列测定证实序列无误。
2.2 GST和GST-MLC2蛋白的表达与纯化 分别用GST蛋白表达质粒pGEX-6P-1和GST-MLC2融合蛋白表达质粒转化的大肠杆菌BL21，与不同浓度（0.08 mM，0.10 mM和0.12 mM）IPTG在37℃孵育3 h均显著诱导GST和GST-MLC2蛋白表达，其分子量均符合预期，大约为28.4 kDa（GST蛋白）和46.6 kDa（GST-MLC2蛋白），而未用IPTG诱导的对照，则未见相应部位出现蛋白条带。Western Blot结果显示GST和GST-MLC2蛋白可被抗GST抗体特异性识别。GST和GST-MLC2蛋白在非变性条件下经谷胱甘肽Sepharose 4B （Amersham）纯化后，虽然仍有少量杂蛋白存在，但纯度已达90%以上（图2）。
2.3 MLC2与TRE17蛋白的相互作用 用TRE17(447)蛋白真核表达质粒HA-TRE17(447)/ pcDNA3转染HeLa细胞后, 以纯化的GST蛋白为对照，用GST-MLC2蛋白进行GST pulldown分析试验。结果显示在GST和GST-MLC2蛋白使用量基本一样时，TRE17(447)与MLC2结合，而阴性对照GST蛋白并不能显著结合MLC2，说明MLC2蛋白能特异性结合TRE17蛋白（图3）。
3 讨 论
细胞恶性转化是一个多因素参与、多基因遗传或表遗传改变和多阶段演进过程。肌动蛋白细胞骨架结构变化引起应激纤维丧失和局部黏附缺失，是恶性转化细胞的特征性变化，主要受到肌动蛋白与肌球蛋白相互作用的影响[7]。我们用酵母双杂交方法发现MLC2是癌蛋白TRE17的结合蛋白[6]。本研究中，在构建并鉴定MLC2原核表达质粒后，我们表达和纯化了GST和GST-MLC2蛋白，并用GST Pulldwon方法进一步证实MLC2与TRE17之间的相互作用。
TRE17癌基因是一个由TBC1D3和USP32融合而成的基因[8]，在多种肿瘤如平衡肌肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、前列腺癌、乳房癌、肾癌和膀胱癌中高表达。由染色体移位所引起的TRE17高表达可导致动脉瘤样骨囊肿[9，10]。TRE17异常表达导致小鼠成纤维细胞NIH 3T3转化为肿瘤细胞，并在裸鼠体内形成肿瘤。然而，TRE17是否通过与MLC2的相互作用导致肿瘤发生有待深入研究。
【】
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