微流控芯片电泳免疫法检测β2微球蛋白

              作者：潘爱平，王惠民，金庆辉，赵建龙

【摘要】  目的：建立一种基于微流控芯片电泳技术的快速微量蛋白检测方法。方法：用过量FITC-β2-MG抗体,与分析体系中β2-MG发生非竞争性免疫反应，FITC-β2-MG抗体和免疫反应形成的荧光免疫复合物通过微流控芯片电泳实现分离，激光诱导荧光检测荧光信号。结果：分别考察了电泳缓冲体系、pH值等对芯片电泳行为的影响，结果表明pH8.33、45mmol/L TBE缓冲液分离效果较好，在此基础上实现了β2-MG标准品的分析，建立了微流控芯片电泳免疫分析方法。结论：微流控芯片电泳免疫分析方法可在2 min内完成一次样品的电泳分析,且试剂和样品消耗少，灵敏度高，改善了常规免疫分析的不足，显示出较好的应用前景。

【关键词】  微流控芯片；毛细管电泳；激光诱导荧光；β2微球蛋白

    Microfluidic electrophoresis immunoassay for β2-microglobulin detection

    [Abstract]   Objective: To establish a method to detect micro-volume protein based on microfluidic chip electrophoresis and immunoassay. Methods: A non-competitive immunoassay was performed based on microfluidic chip electrophoresis. Using FITC labeled β2-microglobulin antibody to capture β2-microglobulin in sample, excessive FITC labeled β2-microglobulin and immune-complex were separated and detected by microchip capillary electrophoresis with laser induced fluorescence. Results: After studying the separation and detection influence factors including electrophoresis buffer conditions,pH value, we got the excellent electrophoresis condition was pH8.33,45mmol/L TBE buffer, 600V/cm separation electricfielde, Based on this electrophoresis condition, the  standard β2-microglobulin detection was successfully performed. Conclusion: Microfluidic chip based electrophoresis immune assay for micro-volume protein detection was introduced. The detection and analysis process was performed within 2 minutes with less sample consuming and high sensitivity. It simultaneously overcame the shortage of routine immunoassay.

    [Key words]   Microchip; Capillary electrophoresis; Laser induced fluorescence; β2- microglobulin

    尿微量蛋白是尿中某些蛋白的排泄呈亚临床升高，而常规方法难以检测的一种病理现象，当尿中出现微量蛋白，可反映肾脏结构与功能的轻度或早期受损[1]，对β2微球蛋白（β2-MG）的检测可用于早期肾小管损伤的监测（如糖尿病肾病、高血压肾病）。毛细管电泳免疫分析(capillary electrophoresis based immunoassay，CEIA)较传统蛋白检测方法简便、快速，但仪器昂贵，从而限制了在临床的应用推广。微流控芯片具有微型化、集成化、分析速度快、试剂消耗少等显著优点，已经在免疫测定[2]、DNA分析和测序[3]、氨基酸和蛋白的分离[4~6]以及生物细胞研究[7,8]等方面发挥出优势。本研究将CEIA和微流控芯片相结合，采用高灵敏度激光诱导荧光检测，用于β2-MG标准品的分析，在优化了缓冲体系成分和pH值等参数的基础上，实现了β2-MG的快速分离和分析，有关临床研究将另文报道。该法比传统免疫及单毛细管方式检测蛋白有更多优势：分析速度快，效率高，样品用量少，检测限低，是今后用于尿液中微量蛋白检测分析最具潜力的方法之一。

    1   材料与方法

    1.1   材料

    1.1.1   微流控芯片   在50 mm×50 mm×1 mm的石英玻璃上，利用标准光刻、湿法腐蚀和键合技术制造微流控芯片[9]，由四个储液池和十字管道构成，其中样品池到十字交叉点长5 mm，有效分离长度为40 mm，储液池直径为2.5 mm，微管道宽约100 μm，深约40 μm。

    1.1.2   激光诱导荧光检测仪   根据共聚焦原理构建的激光诱导荧光检测系统[10]（laser induced fluorescence detector, LIF），氩离子激光器（美国JDS公司）发出波长为488 nm的激光束，经半反半透镜反射至物镜，由物镜聚焦对准芯片微管道检测窗口；当微管道内FITC标记的蛋白经过时将激发出520 nm荧光，激发出的荧光由物镜收集，通过半反半透镜（520 nm），经光电倍增管（photo multiplier tube，PMT)后转换为模拟信号，经过低通滤波和放大后，经模数(analog to digital，A/D)转换为数字信号，由机对信号进行采集和处理。微流控芯片电泳仪、软件处理系统为自行研制，该系统可调输出电压为0～5000 V，实验所得数据用Microsoft Excel和Originpro 7.5进行处理，转换为荧光强度与迁移时间的关系。

    1.1.3   试剂   0.1 mol/L NaOH溶液，45 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸二钠缓冲液（TBE）（pH8.33），10 mmol/L 磷酸盐缓冲液缓冲液（PBS）（pH7.4）实验前新鲜配制，FITC标记的β2-MG抗体（Biolegend公司，货号316303），人β2-MG（Fitzgerald公司，货号30-AM10），三羟甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甘氨酸等试剂均为分析纯，实验用水为去离子水，试剂使用前用0.22 μm滤膜过滤。

    1.2   实验方法   实验前芯片管道清洗程序：去离子水冲洗5 min→抽干→0.1 mol/L NaOH冲洗2 min→抽干→去离子水冲洗5 min→抽干→缓冲液冲洗2 min→抽干→缓冲液注入微管道；实验后芯片管道清洗程序：各储液池抽干→去离子水冲洗5 min→抽干→0.1 mol/L NaOH冲洗2 min→抽干→去离子水冲洗5 min→抽干→10 % SDS 浸泡2 min →抽干→去离子水冲洗5 min→抽干。

    电泳分析时，将FITC标记的β2-MG抗体（FITC-anti-β2-MG）与适量β2-MG孵育物加入样品池，进样时，样品池加500～700 V电压30 s，样品废液池接地，缓冲液池和缓冲液废液池悬空，在电渗流的作用下，试样从样品池经过十字交叉口流向样品废液池；分离时，缓冲液池加+2000～3000 V，缓冲液废液池接地，样品池和样品废液池悬空，存储在十字交叉口处的一段试样溶液在电渗流的推动下进入分离通道进行分离。在碱性条件下，蛋白虽带负电荷，但当电渗流的力大于电荷作用力时，蛋白分子向负极泳动，且分子越小、带负电荷越多的蛋白泳动越慢。

    2   结      果

    2.1   缓冲体系的选择   实验中比较了TBE、磷酸盐缓冲液和Tris-甘氨酸的分离效果，结果表明45 mmol/L的TBE缓冲液基线平稳、出峰较稳定、峰形好。

    2.2   pH的优化   实验优化了pH 8.0～9.0浓度45 mmol/L的TBE缓冲液对分离的影响（图1）。pH 8.03时，约60 s出峰（图1A）；pH8.33时，约40 s出峰（图1B）；pH 8.62和pH 8.92时，约35 s出峰（图1C），随着pH的升高，出峰时间相应提前。

    2.3   β2-MG的检测   用pH 8.33、45 mmol/L TBE电泳缓冲液分别检测了FITC-β2-MG抗体及其免疫反应混合物。FITC-anti-β2-MG在45~60 s时出峰（图2A），FITC-anti-β2-MG过量时的免疫反应混合物电泳时，分子较大的免疫复合物在35～50 s出峰（图2B），当抗原β2-MG过量时，免疫反应混合物电泳主要检测出免疫复合物的双峰（图2C）。

    3   讨      论

    不同缓冲体系不仅影响蛋白带电性和电渗流（EOF）的大小，而且会影响背景信号的高低，从而影响样品的分离度和检出限。由于微流控电泳芯片的通道比较细，PBS在电泳过程中易析出磷酸盐结晶从而堵塞芯片；Tris-甘氨酸分离电流不稳定，从5~60 mA快速变化，变异较大，出峰不稳；TBE缓冲液电泳时基线较平稳、出峰亦稳定、峰形重复性好。

    缓冲液的pH影响微通道管壁的电荷和蛋白所带电荷的多少，从而可改变EOF速率和蛋白质迁移率[11]，蛋白在酸性溶液中易变性，故蛋白电泳大多用偏碱的缓冲液，同时pH还影响蛋白在微通道管壁的吸附程度和免疫复合物的稳定性，因此碱性又不能太强。因此选择在pH 8.0～9.0范围内进行优化，随缓冲液pH的升高，管道内形成的电渗流逐渐增大，蛋白向负极泳动的速度也加快。pH 8.62和pH 8.92的出峰时间相似，可能因为随pH的不断增大，硅羟基的解离渐趋于最大，电渗变化逐渐放平缓；同时pH 8.03时蛋白带负电荷相应减少，与带负电的毛细管壁的静电斥力减小，引起蛋白质吸附和相应的峰扩展，检测到的信号弱（图1A）。缓冲液的pH较大时（图1C,1D），对蛋白和免疫复合物的稳定性影响较大。

    由于微流控芯片电泳与普通区带电泳的原理不完全一样[12]，微流控芯片主要以电渗流作为蛋白区带的驱动力，在碱性条件下，当电渗流的力大于电荷作用力时，蛋白分子向负极泳动，且分子越小、带负电荷越多的蛋白泳动越慢。

【】
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