C6胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移的初步研究
作者：高树梓，高宜录，林社裕，刘道坤
【摘要】 目的：观察体外培养的胶质瘤细胞在体外能否引起神经干细胞的迁移，从而为研究胶质瘤细胞中存在促进神经干细胞迁移的物质打下基础。方法：分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。以星形胶质细胞为对照，做细胞迁移实验，观察其结果；将C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的无血清培养上清分别浓缩，并行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察其结果。结果：（1）C6胶质瘤细胞的培养上清引起神经干细胞迁移的数目明显多于星形胶质细胞的培养上清和新鲜无血清培养基（P＜0.01）；（2）将无血清培养的等浓度的C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的上清浓缩蛋白电泳，可见二者蛋白条带存在明显差异。结论：（1）从新生大鼠大脑皮层组织可以培养出神经干细胞和星形胶质细胞。（2）C6胶质瘤细胞无血清培养的上清中存在着能够诱导神经干细胞迁移的物质。
【关键词】 胶质瘤细胞；神经干细胞；星形胶质细胞；细胞迁移
已有研究发现胶质瘤细胞而且在体内可以诱导神经干细胞向胶质瘤方向迁移[1，2]。尽管未成熟神经元迁移的机制十分复杂，但其迁移的方向和路径的识别与局部的某种信号物质有关。胶质瘤细胞中是否存在这种信号物质尚未见报道。我们采用体外培养技术，观察C6胶质瘤细胞的培养上清在体外有无诱导神经干细胞迁移的作用。为进一步通过生化技术将胶质瘤细胞中的该信号物质进行分离和纯化打下基础。为将该信号物质与神经干细胞一起应用于临床，提高脑及脊髓损伤、胶质瘤和中枢神经系统退行性疾病的效果奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 （1）实验动物、细胞：新生SD大鼠（由南通大学实验动物中心提供）；C6胶质瘤细胞株（中科院上海细胞所）。（2）试剂及抗体：DMEM/F12，B27 Serum-Free Supplement（Invitrogen公司）；碱性成纤维生长因子 (Peprotech公司)；5-溴-2脱氧尿苷(Neomarkers公司)；小鼠抗-Nestin IgG1（Chemicon公司）；小鼠抗5-溴-2脱氧尿苷IgG1（Neomarkers公司）；小鼠抗胶原纤维酸性蛋白IgG1和异硅氰酸荧光素抗小鼠IgG（Sigma公司）。
1.2 细胞培养及鉴定方法 （1）神经干细胞的培养及鉴定：从新生SD大鼠大脑皮层分离培养神经干细胞。用无血清培养基DMEM∕F12培养约7d，使得神经干细胞处于指数生长期。贴壁、固定、洗涤后用含10%羊血清、0.3% Triton-100的0.01mol/L PBS液在37℃条件下封闭孵育10min。加一抗（小鼠抗Nestin IgG，1∶500倍稀释），4℃过夜，洗涤加入二抗（FITC标记的羊抗小鼠IgG，按1∶150稀释），避光37℃孵育30min。共聚焦显微镜下观察。细胞传代能力鉴定5-溴-2脱氧尿苷免疫荧光检测：将获得的原代神经球吹打制成单细胞悬液，接种至含5-溴-2脱氧尿苷浓度为5μmol/L的培养液中培养5~7d即可形成次代神经球。贴壁、固定、封闭，免疫荧光染色和观察均同前。小鼠抗5-溴-2脱氧尿苷IgG1按1∶1000倍稀释，FITC标记的羊抗小鼠IgG，按1∶200倍稀释；（2）星形胶质细胞的培养及鉴定：从SD新生红皮鼠大脑皮层分离星形胶质细胞，用含20%小牛血清培养基DMEM/F12培养约28天，使得星形胶质细胞处于指数生长期。免疫荧光法检测培养细胞的胶质原纤维酸性蛋白表达方法同前。小鼠抗胶质原纤维酸性蛋白IgG1，按1∶500倍稀释,FITC标记的羊抗小鼠IgG，按1∶200倍稀释；（3）C6胶质瘤细胞培养：用含20%小牛血清的DMEM/F12培养基培养4~6d，待细胞生长处于对数期时使用；（4）细胞迁移实验：用多聚碳酸膜有8μm微孔的“Transwell” 细胞培养室进行迁移实验。细胞迁移实验前36h，把培养C6胶质瘤细胞和星形胶质细胞的含小牛血清的上清去掉，用0.01mol/L PBS冲洗3遍，然后换上无血清的DMEM/F12培养基培养36h。迁移实验时共分3组，基本培养基为第1组：在细胞培养室的下室加入无血清培养基600μl；C6细胞培养上清为第2组：在细胞培养室的下室加入C6细胞无血清培养基培养的上清400μl和200μl无血清培养基；星形细胞培养上清为第3组：在细胞培养室的下室加入星形胶质细胞无血清培养基培养的上清400μl和200μl无血清培养基。在上述3组的细胞培养室的上室加入神经干细胞悬液（6.7×102个/ml)200μl,共培养36h。取出培养杯，甲醇固定10min，PBS洗3次； Giemsa染色10min，PBS洗3次；用解剖刀取下膜，转置在自制的带网格的载玻片上，取中间9个格进行光镜下放大100倍计数。
1.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）星形胶质细胞与C6胶质瘤细胞上清蛋白的浓缩：将无血清培养36h的星形胶质细胞上清和C6胶质瘤细胞上清分别用吸管转移至离心管中12000rpm/min离心约1~2min，取上清按20μl/ml的比例加入蛋白酶抑制剂组合后，转移到截留分子量为3kD的centricon型微型浓缩器中，7500rpm/min离心120min。样品管中则留下微量浓缩的上清蛋白，翻转样品管和储液帽，100rpm/min离心2min后，于储液帽中得到星形胶质细胞上清浓缩蛋白，其浓度较浓缩前能提高约40倍；（2）蛋白定量实验：取适量考马斯亮蓝CBBG250贮备液用双蒸水1∶4稀释配成应用液。取适量蛋白标准品（62.8g/L）用生理盐水稀释成1.3mg/ml以下的浓度备用。取等体积的浓缩的C6 胶质瘤细胞上清蛋白和星形胶质细胞上清蛋白分别用生理盐水按1∶9稀释成10%的溶液待测。取4个eppendorf管，按表1进行分组，充分混匀后静置10min。于96孔培养板中选并排的4个孔，分别加入上述4管溶液各200μl，每个样品测2次作一重复。利用BIO-TEKELX800酶标仪在570nm处进行检测。根据检测结果，在C6胶质瘤细胞的浓缩上清中加适量PBS使其最终蛋白浓度与星形胶质细胞相等；（3）蛋白电泳：在等浓度的C6 胶质瘤细胞上清和星形胶质细胞上清的浓缩蛋白样品液中分别加入等量上样缓冲液。经12%聚丙烯酸胺凝脂电泳后，一块经CBB染色，另一块转移至PVDF膜，染色，剪下差异蛋白条带测序。
1.4 统计学方法 数据统计采用Stata7.0软件，组间比较采用方差分析，两组间比较采用最小显著差数法。
2 结果
2.1 星形胶质细胞培养和GFAP免疫荧光检测 分离的大鼠大脑皮层细胞在原代培养（种植）4h后，部分细胞即可长出细小胞突，培养3~4d后，细胞数量便明显增加,随着培养时间的延长，培养物中星形胶质细胞的比例越来越大，而神经元及其它细胞成分的比例越来越小。大鼠大脑皮层细胞原代培养一般在9~14d，以星形胶质细胞为主的细胞即可长满培养瓶壁，可见到少突胶质细胞生长在星形胶质细胞层上。经传代后星形胶质细胞的比例更高,几近单一细胞培养物。镜下体外培养的星形胶质细胞胞体较大、很扁，形状不规则，胞质较丰富，细胞核圆形或卵圆形，长偏于胞体的一侧，内有1~2个核仁。胞突尤其是初级胞突较多较长。
我们对培养的胶质细胞进行GFAP免疫荧光检测显示,绝大多数细胞表现为GFAP阳性，说明培养的细胞是星形胶质细胞(图1)。
2.2 神经干细胞培养和鉴定 新生大鼠大脑皮层细胞在接种后大部分存活，胞体光滑圆润,胞质透亮，24~48h内细胞开始聚集，形成细胞团，随后聚集的细胞迅速分裂，细胞团中的细胞数量快速增加，至3~4d已初步形成神经球，培养至1w左右时每个培养瓶中可形成数十个至百余个呈悬浮生长、大小基本一致、形态规则的神经球，绝大多数神经细胞球周围无突起生长，有少数神经细胞球之间有少量突起相连，有极少量神经细胞球沉至瓶底及少量神经干细胞长出突起而分化。另外可观察到在接种密度较高或较低时，神经干细胞均生长不良，形成的神经球数目减少。
我们所培养的神经球内的几乎所有细胞均呈nestin阳性，nestin为神经干细胞的标志物从而证明该细胞球是神经干细胞球（图2）。
我们将神经干细胞球用含5-BrdU的培养液制成单细胞悬液并培养，7d左右可形成次代神经细胞球。对次代神经细胞球进行抗-BrdU免疫荧光检测显示：次代神经细胞球中，绝大多数细胞呈BrdU阳性，BrdU为细胞增殖的标志，说明次代神经细胞球中大部分细胞具有分裂增殖能力（图3）。
2.3 细胞迁移实验结果 每次实验每组做3个孔，实验共重复3次。每孔的迁移细胞球数为光镜下放大100倍，中间9个格中的平均数，结果见表2。
方差分析结果显示组间差异有统计学意义（F=34.8519，P＜0.01）。各组间进行多重比较，采用最小显著差数法：LSD0.05=5.7437 LSD0.01=7.7837，见表3。
从统计结果可以看出，C6胶质瘤细胞的上清引起神经干细胞迁移的数目与星形胶质细胞的上清，新鲜无血清培养基在极显著水平上有统计学意义，星形胶质细胞与新鲜无血清培养基也在极显著水平上有统计学意义（图4、5），说明C6胶质瘤细胞的上清明显地促进了神经干细胞的迁移。
2.4 SDS-PAGE实验结果 电泳结果显示C6胶质瘤细胞的浓缩上清与星形胶质细胞的浓缩上清间存在差异蛋白，即在C6胶质瘤细胞的上清蛋白条带中存在特异蛋白条带（图6）。
3 讨论
3.1 神经干细胞的培养 神经干细胞的研究一直是神经界的一个热点，如何快速地培养出神经干细胞具有重要的现实意义。从实验用神经干细胞获取的角度看，从胎脑的纹状体区和海马齿状回容易获得，但对动物和取材技术要求较高。用成熟大鼠取材对培养技术和培养基要求也较高，不易存活。目前多数研究者采用胎鼠组织作为神经干细胞的组织来源，我们采用新生3~5d的大鼠作为神经干细胞的组织来源，应用DMEM/F12为基础培养基，在此基础上添加不同成分，培养出了具有分裂增殖能力的神经干细胞。此法具有实验动物容易获得、取材简单、省时经济、一次可获得大量神经干细胞和神经干细胞易成活的优点。
3.2 C6胶质瘤细胞培养上清对神经干细胞的迁移作用 大量研究表明，神经干细胞具有迁移追踪肿瘤细胞的能力[1]，胶质瘤对神经干细胞的诱导迁移作用在体内也已被证实[1，2]。这说明胶质瘤的生长环境中或胶质瘤细胞本身存在某些因子诱导神经干细胞发生了迁移。既然胶质瘤细胞能产生这种信号物质，那么在体外培养的胶质瘤细胞是否也具有该物质，对此尚未见报道。我们在体外培养条件下，通过transwell细胞培养室进行细胞迁移实验，观察胶质瘤细胞对神经干细胞的迁移作用，研究结果显示，与星形胶质细胞上清相比，C6胶质瘤细胞的上清明显地促进了神经干细胞的迁移，且在C6胶质瘤细胞的上清蛋白条带中存在特异蛋白条带，说明在C6胶质瘤细胞的培养上清中也存在促使神经干细胞迁移的物质。已有研究表明神经干细胞的迁移机制有早期的辐射状迁移和中晚期的链状迁移[3，4]。可能与细胞的成熟程度、细胞的周围环境以及细胞所在的基质的状态、细胞间的通讯、干细胞自身及临近或远隔部位其他细胞所分泌的细胞因子、黏附分子、激素、递质细胞代谢产物等有关。
另外，实验选用星形胶质细胞作为对照，是因为在腹侧梨状皮质区和嗅球表达的干细胞进行远距离迁移与胶质细胞无关[5]，况且星形胶质细胞在脑内分布十分广泛，而移植入脑内的神经干细胞总向一些特定区域迁移，实验结果也表明神经干细胞的迁移与星形胶质细胞无关。
本研究蛋白电泳显示，胶质瘤细胞和星形胶质细胞之间，不仅有蛋白量的差异，也有着质的不同。尽管我们目前还未能证实这些差异蛋白哪些能诱导神经干细胞的迁移，但这已为寻找胶质瘤中引起神经干细胞迁移的物质打下了基础，为神经干细胞应用于临床，提高脑及脊髓损伤、胶质瘤和中枢神经系统退行性疾病的效果提供理论依据。
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