60例胃腺癌微淋巴管密度的研究
【摘要】 目的 探讨胃腺癌中微淋巴管的分布特点及其与淋巴结转移的关系。方法 采用微淋巴管特异标记D2-40对60例胃腺癌的癌中心组织、癌边缘区组织及其相应正常组织进行免疫组织化学染色检测微淋巴管密度，以CD34标记血管作对比。结果 胃癌中心未见明显微淋巴管；边缘区微淋巴管明显增多，胃癌边缘区淋巴管密度较正常胃组织增高(P<0.01)，胃癌边缘区微淋巴管密度与胃腺癌分化程度与淋巴结转移有关(P<0.05或0.01)。结论 胃癌组织边缘区存在新生微淋巴管，癌周围微淋巴管密度增加与胃腺癌分化程度及淋巴结转移有关，胃癌边缘区微淋巴管密度测定对淋巴结转移可能性的判断具有一定意义。
【关键词】 胃肿瘤；淋巴管新生；微淋巴管密度；淋巴转移；肿瘤转移
Abstract： Objective To investigate the distribution patterns of lymphatic microvessel in gastric adenocarcinoma and their relationship with lymphonode metastasis of gastric adenocarcinoma. Methods In central cancer tissues，the peritumoral tissues and correspondent normal tissues of 60 patients with gastric adenocarcinoma，the expression of D2-40 and CD34 were detected by immunohistochemistry，by which the lymphatic microvessel density (LMVD) was calculated. Results The microvessel tissues were not found in central gastric carcinoma.An elevated microvessel tissues were shown in peritumoral gastric adenocarcinoma，compared to normal tissues，there was a significant difference (P<0.01).The microvessel density in peritumoral tissues of gastric carcinoma was associated with the differentiation degree and the lymphatic metastasis (P<0.05 or 0.01). Conclusion The lymphangiogenesis is shown in peritumoral tissues in gastric adenocarcinoma，elevated LMVD in gastric adenocarcinoma showed positive relations with lymphatic metastasis and differentiation type.
Key words： stomach neoplasms；lymphangiogenesis；lymphatic microvessel density；lymphatic metastasis；neoplasm metastasis
肿瘤淋巴道转移机理与肿瘤新生淋巴管（淋巴管新生）研究成为继血管生成机理研究的前沿领域，新的淋巴管的特异性标记物的发现为深入淋巴管机理的研究提供了可能。新近研究表明［1］，许多肿瘤可能存在新生淋巴管机理，通过用淋巴管内皮细胞表面标记证实在肿瘤周围存在着淋巴管新生和淋巴管扩张的现象，肿瘤具有使其周围淋巴管数目增加的特性，导致其转移的可能性得到提高。本组在同一组织中用单克隆抗体D2-40和CD34两种免疫组化方法，对人胃腺癌组织进行微淋巴管与微血管的染色，观察微淋巴管的分布特点，探讨其与淋巴结转移的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取60例2001～2002年桂林医学院附属行根治术切除原发性胃癌病例，高、中、低分化腺癌各20例；要求包癌中心组织、癌边缘区组织和相应周围大致正常组织，癌边缘区组织距肿物边缘0.3cm以内，周围大致正常胃壁组织距肿物边缘≥5cm。其中有淋巴结转移者38例，无淋巴结转移22例。所选病例男34例，女26例；年龄34～60岁，平均52.3岁。
1.2 免疫组织化学染色 联合运用两种免疫组化D2-40（M2A）和CD34。淋巴管特异标记D2-40对60例胃癌组织、癌边缘区组织及其相应正常组织进行免疫组织化学染色检测微淋巴管密度，以CD34标记微血管作为对比。常规石蜡切片共4张，一张为HE常规染色，两张分别以D2-40和CD34为一抗标记微淋巴管和微血管，一张以PBS代替抗体作为阴性对照。D2-40(购自美国SantaCruz公司)和CD34抗体(福州迈新生物技术公司)免疫组织化学染色方法按两步法步骤进行，经DAB显色后，苏木素复染，中性树胶封片，PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定 D2-40和CD34阳性的判定以细胞质染色有清晰淡黄色至棕黄色颗粒。本组将D2-40+/CD34-管腔视为微淋巴管，将CD34+管腔视为微血管。管腔的判定标准：棕黄色细长管壁包绕的条索状或塌陷状不规则形的管腔，内无红细胞，由大且向腔内突出的单层内皮细胞构成。
1.4 结果计数 参照Ohno M等［2］报道方法进行微淋巴管密度计数；微淋巴管密度计数方法为每张切片先在低倍镜下先选取胃癌组织、癌周组织、以及周围正常组织阳性染色脉管最丰富区，确定5个管腔着色最密集的区域，然后在高倍光镜视野（400倍）下分别对微淋巴管进行计数，每例数5个视野，然后取其平均值进行统计学分析。
1.5 统计学分析 采用t检验，统计学处理采用 SPSS10.0统计分析软件。
2 结果
2.1 微淋巴管结构和分布特点 通过免疫组织化学染色，本组60例中有5例(8.33%) 癌组织、癌旁组织及正常胃癌组织中均未见D2-40阳性的淋巴管。其余55例(91.67%) 在癌组织、癌旁组织及正常胃组织中均可见D2-40+/CD34-的淋巴管。光镜下观察发现，淋巴管内皮染色为棕黄色，呈条索状或不规则裂隙状。在癌边缘区组织淋巴管壁薄，缺乏基底膜，散在或成簇分布，部分扩张或形成狭窄的腔隙。正常胃组织淋巴管形态正常，分布于胃壁各层中，以粘膜下层最多，淋巴管数目较癌边缘区减少。原发性胃癌组织中心区未见明显开放性淋巴管。高分化腺癌与低、中腺癌相比，微淋巴管数目有明显差异；有淋巴转移患者微淋巴管数目比没有淋巴转移患者增多。
2.2 胃腺癌边缘区组织与周围正常组织微淋巴管密度比较 胃癌边缘区组织微淋巴管密度(9.25±3.06个/HP×400)较周围正常胃组织微淋巴管密度(4.27±0.93个/HP×400)增高(t=11.55，P＜0.01)。
2.3 高、中、低分化胃腺癌边缘区组织微淋巴管密度比较 高分化腺癌阳性表达17例，边缘区组织微淋巴管密度为6.45±1.06个/HP×400；中分化腺癌阳性表达19例，边缘区组织微淋巴管密度为10.18±2.34个/HP×400；低分化腺癌阳性表达19例，边缘区组织微淋巴管密度为11.02±1.53个/HP×400。两两比较可见高分化腺癌与中、低分化腺癌比较差异均有显著性(t分别为6.27与10.29，P<0.05或0.01)，而中、低分化腺癌比较差异无显著性(t=1.31，P>0.05)。
2.4 有无淋巴结转移病例胃腺癌边缘区组织微淋巴管密度比较 在胃腺癌边缘区组织有淋巴转移患者36例，微淋巴管密度为11.32±2.43个/HP×400；无淋巴结转移患者19例，微淋巴管密度为7.53±1.20个/HP×400；前者微淋巴管密度明显增高(t′=7.74，P＜0.05)。
3 讨论
淋巴道转移是恶性肿瘤最常见、最重要的转移途经。SabinF在上世纪初通过对猪胚胎发育的研究认为一部分内皮细胞从静脉出芽生长后形成原始淋巴囊，然后再向周围蔓延生长形成淋巴管系统，在发育过程中与血管系统相互连通。但多年来对其转移过程和机理不甚清楚，主要原因是没有可靠的淋巴内皮标记物，近年来，VEGF-C、D的克隆成功以及淋巴管内皮细胞特异标记物(如podoplanin、prox-1、LYVE-1、D2-40等)的相继发现，逐渐为肿瘤淋巴管生成研究提供了较为可靠的手段。单克隆抗体D2-40［3，4］是氧连接型唾液酸糖蛋白，仅存在于淋巴内皮细胞上，目前被广泛作为淋巴管的特异性标记物。
最近的研究［5］，通过用淋巴管内皮细胞表面标记证实在肿瘤周围存在着淋巴管新生和淋巴管扩张的现象，肿瘤具有使其周围淋巴管数目增加的特性，通过肿瘤边缘组织的淋巴管而进入淋巴系统造成淋巴结转移，导致其转移的可能性得到提高。已在食管癌、胃癌、大肠癌、黑色素瘤等疾病中发现有淋巴管新生，新生淋巴管在肿瘤周边部呈扩张状。体内动物实验［6］证实，通过抑制VEGF-D、VEGF-C的表达，抑制肿瘤的淋巴管新生，可抑制肿瘤的生长速度和大小癌组织内的微淋巴管密度明显低于正常组织(P<0.05)，癌巢间隙的微淋巴管数目少，可能因为肿瘤组织过度生长使原有的淋巴管结构破坏，并挤压原有的淋巴管，使癌巢间隙的淋巴管数目减少，管腔变窄。癌组织内可能并无新生淋巴管生成。本实验结果与此相吻合。
肿瘤边缘淋巴管新生这一概念已经渐渐被人们所接受。在肿瘤过程中，肿瘤边缘相关的淋巴管形成，淋巴管增生，促进肿瘤细胞的淋巴管转移。本实验结果与其相吻合，胃腺癌边缘组织的微淋巴管密度比周围正常粘膜差异有显著性(P<0.01)。本实验比较了高、中、低分化腺癌边缘组织微淋巴管密度的差异，结果可知高分化腺癌与中、低分化腺癌差异有显著性(P<0.05或0.01)，而中低分化腺癌间差异无显著性(P>0.05)，与Xing-E Liu等［7］相吻合，可见胃癌分化程度与微淋巴管密度密切相关。
但是，Wilting等［8］最近指出，“一个完全公开的问题是肿瘤淋巴系统的发展和淋巴转移灶形成的关系。”Michael S.Pepper等［9］指出VEGF-C本能地引起人类肿瘤，和肿瘤细胞到局部淋巴结促进淋巴管新生与播散相关联。然而不知道是原来的淋巴管有效完成这个功能，还是转移需要毛细淋巴管的重新形成(淋巴管新生)，Leu A.J［10］提出不一定产生淋巴管新生，原来的淋巴系统扩大VEGF-C在肿瘤中的反应将能足够的论证这种假设正确，可能有必要调用VEGF-C非淋巴管新生的功能促进淋巴结转移，这可能包括营养的产生，促有丝分裂或VEGF-C刺激淋巴上皮产生趋化因子，或改变淋巴上皮细胞的粘附性等。目前，对这种潜在的交互作用一无所知。
VEGF-C、VEGF-D/VEGFR-3信号通路异常可能是肿瘤淋巴管生成或扩张的机理，因此，通过应用VEGFR-3的中和抗体、可溶性细胞外片段或低分子量抑制物抑制该信号通路，可能是抗肿瘤淋巴道转移的一种新方法［11］。对于主要经淋巴道转移的肿瘤可采用肿瘤新生淋巴管抑制剂治疗，如目前实验阶段的VEGFR-3抗体通过阻断VEGF-C与VEGFR-3的结合从而抑制肿瘤的淋巴管生成与转移。抗肿瘤新生淋巴治疗有希望成为继抗肿瘤新生血管治疗之后的又一肿瘤生物治疗新模式，具有美好的应用前景［12］。淋巴管新生有利于肿瘤病人的早期发现、早期治疗及康复。
【】
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