姜黄素对MPP+诱导PC12细胞凋亡的抑制作用
作者：陈静，李波，李红军，肖长义
【摘要】 目的 观察姜黄素(Curcumin，Cur)对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的影响，并且探讨其作用机理。方法 采用MTT法检测细胞存活率，碘化丙啶染色流式细胞术(FCM)检测PC12细胞凋亡，罗丹明123染色FCM检测细胞线粒体膜电位（△Ψm），双氢罗丹明123染色FCM检测细胞内活性氧（ROS）的含量。结果 不同浓度MPP+作用PC12细胞24h后，细胞存活率显著下降(P<0.01)，与单纯MPP+处理组比较，20μmol/L Cur和不同浓度的MPP+同时处理PC12细胞24h后，细胞存活率显著升高(P<0.01)；一定浓度的Cur对PC12细胞作用24h后无明显凋亡诱导作用，但可使MPP+处理组细胞凋亡率下降(P<0.01)；20μmol/L Cur可抑制MPP+引起的PC12细胞△Ψm降低及细胞内ROS含量增多。结论 姜黄素可以抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡，其作用机理可能与维持线粒体正常膜电位，稳定线粒体功能，清除ROS有关。
【关键词】 姜黄素；1-甲基-4-苯基-吡啶；细胞凋亡；活性氧；帕金森病
Abstract: Objective To investigate the cytopretection of curcumin (Cur) against PC12 cell apoptosis induced by 1-methyl-4-phenylpyridium (MPP+) and the mechanisms. Methods A MTT assay was used to detect the cell vitality, and PI staining flow cytometry (FCM) was used to analyze the PC12 cell apoptosis, fluorescent probe of rhodamine 123 staining was used to measure the mitochondrial potential (△Ψm), dihydrohodamine 123 (DHR) staining FCM was used to detect the levels of reactive oxygen species (ROS). Results PC12 cells were exposed to different concentrations of MPP+ for 24 hours. The cells vitality decreased significantly (P<0.01). Compared to MPP+ alone group, after treated with 20μmol/L Cur in combination with different concentrations of MPP+, the cell vitality elevated significantly (P<0.01). The indicate concentrations of Cur did not induce apoptosis in PC12 cells. However, the proportion of PC12 cells apoptosis induced by MPP+ decreased significantly after treated with Cur (P<0.01). 20μmol/L Cur could prevent the decrease of △Ψm and the elevation of ROS induced by MPP+. Conclusion Cur can inhibit the PC12 cells apoptosis induced by MPP+, its mechanism may be associated with maintenance of △Ψm and removal ROS.
Key words: curcumin; 1-methyl-4-phenylpyridium; apoptosis; reactive oxygn species; Parkinson disease
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的中枢神经系统变性疾病，形态学研究表明PD病人脑内多巴胺（Dopamine, DA）能神经元呈凋亡样改变，提示细胞凋亡可能参与了PD的发病过程［1］，但其具体机理尚未完全明了，目前认为可能与线粒体功能障碍、氧化应激反应增强导致活性氧(ROS)过多有关。目前还没有根治帕金森病的有效方法，现有的主要方法只能在发病初期缓解症状，随着用药时间的延长，药效逐渐下降，并且常常出现严重的副作用［2］。因此现在研制和开发疗效高、副作用少、能真正阻止病程的治疗药物是临床迫切需要解决的问题。
近年来天然药物在治疗神经退行性病中的作用已经引起各国学者的广泛关注。姜黄（Curcuma longa L）是一种多年生的草本植物，在亚洲的热带地区广为栽培。Cur是从姜黄根茎中提取的一种酚性色素，是姜黄的重要活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血脂等广泛的药理作用，但在保护神经元方面的研究少见。
1-甲基-4-苯基-吡啶（1-methyl-4-phenylpyridium,MPP+）可以引起大鼠脑DA能神经元凋亡，成功复制PD模型。大鼠嗜铬细胞瘤细胞系（Pheochromocytoma，PC12）在细胞形态、结构和功能上与神经元极其相似，能与原代培养的神经细胞说明一致的问题，并且其含有的膜受体及合成的递质与黑质DA能神经元相似，因此该细胞株可作为DA能神经元模型。所以MPP+制备的PC12细胞模型常作为研究PD的细胞模型［3］。本试验小组选择MPP+诱导PC12细胞凋亡，复制PD模型，观察Cur对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用，并对其可能的作用机理进行初步探讨，为今后深入研究Cur在治疗PD中的作用及其机理提供实验依据，也为研发天然抗PD药物提供新思路和新方法。
1 材料与方法
1.1 试剂 Cur，MPP+，四氮唑蓝（3-［4,5-dimethylthiazol-2-yl］-2,5 diphenyltetrazolium bromide, MTT），碘化丙啶( Propidium iodide, PI)，罗丹明123（Rhodamine123，Rh123），双氢罗丹明123（Dihydrohodamine123，DHR），二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）购自Sigma公司；RPMI-1640培养基，马血清和胎牛血清购自GibcoBRL公司；胰蛋白酶购自华美生物试剂公司。
1.2 仪器 流式细胞仪，美国BECKMAN-COULTER公司产品；倒置荧光显微镜，日本Olympus公司产品；二氧化碳孵箱，Hera Cell 公司产品；离心机，上海安亭仪器厂产品。
1.3 细胞培养和药物处理 PC12细胞株置于含10%马血清、5%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃、5%CO2条件下培养。在细胞对数生长期加入药物处理，实验分组为:①空白对照组(control):在细胞培养体系中不加入任何药物；②Cur组:在细胞培养体系中加入Cur；③MPP+组:在细胞培养体系中加入MPP+；④Cur加MPP+组:在细胞培养体系中加入Cur和MPP+。各实验组设三个平行对照。
1.4 MTT比色法检测细胞存活率 取对数生长期细胞，以0.5×105/ml接种于96孔培养板，100μl/孔。在37℃、5%CO2条件下培养过夜后，按分组要求给以不同处理因素。培养24h后，每孔加5mg/ml MTT 20μl，再培养4h，倾去培养液，加DMSO 150μl/孔，待甲月赞完全溶解后，用酶联免疫仪在波长570nm处检测各孔光密度值（Optical density，OD）。细胞存活率：（试验组吸光度/对照组吸光度）×100%。
1.5 PI染色流式细胞术（FCM）检测PC12细胞凋亡 各实验组细胞按要求处理后，2.5g/L胰蛋白酶消化贴壁的PC12细胞，1000r/min离心10min，去上清，PBS漂洗2次，沉淀中加入体积分数为0.70的乙醇固定。1000r/min离心10min，去上清，PBS 漂洗2次，调整细胞浓度为1×106/ml。加50μl RNase 至终浓度1g/L，37℃水浴30min。加PI至终浓度50mg/L，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，4℃避光染色30min后，上流式细胞仪检测各期细胞DNA的含量。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以DNA组方图出现低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代表凋亡细胞的多少，计算凋亡率。
1.6 细胞线粒体膜电位（△Ψm）的检测 药物处理24h后，用0.25g/L胰蛋白酶消化贴壁的PC12细胞，收集1×106/L细胞用PBS洗两次。取储存于－20℃、溶于DMSO的1g/L Rh123，用不含小牛血清的RPMI-1640稀释至100μg/L，重悬上述细胞，避光于37℃孵育45min后进行流式细胞仪测定，测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理。计数10000个活细胞，以阳性细胞的平均荧光强度（mean flourscence indensity，MFI）表示△Ψm。
1.7 细胞内ROS含量的检测 药物处理12h后，倾去陈旧培养基，用无血清的RPMI-1640洗2次，加入用无血清的RPMI-1640稀释至终浓度为1μmol/L的DRH，避光于37℃孵育1h后，收集细胞，PBS洗1次，制成1×105/ml的悬液，上流式细胞仪检测，测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理。每个样品测定10000个活细胞，直方图分析Rh123 的平均荧光强度（MFI），该值即代表细胞ROS水平。
1.8 统计学处理 全部数据经SPSS 11.0统计软件进行统计分析，计量数据用±s表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验，有显著意义后用最小有意义差异检验进行均数间的多重比较，检验水准a=0.05。
2 结果
2.1 姜黄素对MPP+诱导PC12细胞存活率下降的影响 0.25、0.5、1.0 和2.0mmol/L MPP+作用PC12细胞24h后，细胞存活率分别为（45.2±1.5）%、（36.5±1.4）%、（31.2±2.5）%和（23.6±1.2）%，与对照组分别比较，PC12细胞的存活率极显著地下降(F=81.47，P<0.01)，提示在0.25～2.0mmol/L浓度范围内，随着浓度的增加，MPP+对PC12细胞存活率的抑制作用也逐渐增大，有呈剂量效应的趋向。
但是，20μmol/L Cur和不同浓度的MPP+同时处理PC12细胞24h后，细胞存活率分别升高至（72.5±0.9）%、（66.0±2.4）%、（49.0±1.8）%和（42.8±0.7）%，分别与不同浓度的MPP+实验组的细胞存活率比较差异均有高度显著性（F=299.44，P<0.01），提示姜黄素可部分地拮抗MPP+对PC12细胞存活率的抑制作用。
2.2 姜黄素对MPP+诱导PC12细胞凋亡的影响 采用PI染色FCM检测PC12细胞凋亡情况，结果发现：空白对照组PC12细胞的凋亡率为(1.5±0.1)%，0.5mmol/L MPP+作用PC12细胞24h后，细胞的凋亡率为(51.9±2.1)%，与空白对照组比较差异有高度显著性(F=1789.28，P<0.01)。分别加入20、40μmol/L Cur同时处理24h后，PC12细胞的凋亡率分别降为（38.5±0.6）%和（22.6±0.9）%（F=363.91，P<0.01）。图1显示20、40μmol/L Cur本身不引起PC12细胞凋亡(P>0.05)，但能够抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡。
2.3 姜黄素对MPP+抑制PC12细胞线粒体膜电位的影响 PC12细胞经Rh123染色，通过FCM检测细胞Rh123的荧光强度，结果显示，正常对照组的MFI为（47.9±0.4），PC12细胞经20μmol/L Cur处理后，其平均荧光强度为（45.5±2.1），两者差异无显著性(F=3.92，P>0.05)，表明20μmol/L Cur处理并不改变PC12 细胞的△Ψm。0.5mmol/L MPP+作用24h后，PC12细胞的MFI非常明显地下降至（17.1±2.2）（F=564.19，P<0.01）；而加了20μmol/L Cur处理的PC12细胞在0.5mmol/L MPP+作用24h后，PC12细胞的MFI仅下降到（24.8±1.8），与MPP+组的MFI值比较，两者差异有高度显著性（F=227.46，P<0.01），表明20μmol/L Cur处理可部分拮抗MPP+引起的PC12细胞△Ψm下降。
2.4 姜黄素对MPP+引起PC12细胞内ROS改变的影响 应用荧光探针DHR检测细胞内ROS含量，以了解给予MPP+后细胞内ROS的变化，并观察姜黄素对这种变化的影响。结果显示，对照组PC12细胞内MFI为（5.0±0.2），而0.5mmol/L MPP+作用24h后，PC12 细胞的MFI为（19.7±0.8），较对照组明显增强（F=953.00，P<0.01），表明给予MPP+后，引起细胞内ROS的含量显著升高；20μmol/L Cur处理并不改变PC12细胞的MFI，但合用20μmol/L Cur和0.5mmol/L MPP+后，PC12细胞的MFI为（5.4±0.3），较MPP+组明显降低（F=840.46，P<0.01），表明姜黄素可明显地抑制MPP+引起的PC12细胞内ROS含量升高。
图1 PI染色FCM检测PC12细胞凋亡（略）
(A)对照组；(B)40μmol/L Cur处理组；(C) 0.5mmol/L MPP+处理组；(D) 0.5mmol/L MPP+和20μmol/L Cur处理组；(E) 0.5mmol/L MPP+和40μmol/L Cur处理组
3 讨论
细胞发生死亡的方式有两种：坏死和凋亡。研究发现，当凋亡发生异常时，可导致机体细胞非正常的生理性死亡而致病。神经元凋亡的研究近几年受到人们的高度重视，很多证据表明它在PD发病中起着重要作用，抗凋亡已成为防治PD 的研究热点之一。神经毒素MPP+诱导细胞凋亡的方法是研究PD发病原因及药机理最常用的模型。本实验表明，0.5mmol/L MPP+作用于PC12细胞24h后，细胞存活率明显降低。同时，用流式细胞分析仪观察了细胞的凋亡情况，发现MPP+作用24h后，在细胞的DNA组方图中可出现不同程度的低于G1期DNA含量的凋亡峰，亦表明MPP+可诱导神经细胞凋亡。
在细胞凋亡中，线粒体起着中心调控的作用［4,5］。正常△Ψm可以调控线粒体内膜对各种物质的选择性和通透性，从而维持线粒体的正常结构与功能［6］。荧光探针Rh123的荧光强度可反映△Ψm 高低，我们的结果显示0.5mmol/L MPP+引起PC12 细胞Rh123荧光强度下降，提示MPP+能引起PC12细胞的△Ψm明显降低。结果还显示0.5mmol/L MPP+能引起PC12细胞内ROS明显增多。有研究提示［7］，ATP、ROS、△Ψm 三者之间的关系影响线粒体的功能，进而影响到细胞的正常结构与功能，以及细胞凋亡的产生与。ROS增多时，线粒体的膜系统可受到损害，使△Ψm 降低，从而影响跨越线粒体膜的质子梯度，使线粒体合成ATP的功能发生障碍。同时线粒体的功能障碍又可导致自由基产生增多，过多的ROS不能被及时清除，又可引起生物膜结构蛋白质和脂质过氧化，损害线粒体膜的通透性，引起传递链活性的进一步下降，从而形成恶性循环，使ROS生成进一步增加，最终造成细胞凋亡［8］。综上所述，一定浓度的MPP+可引起PC12细胞凋亡，其作用机理可能与引起△Ψm降低及细胞内ROS含量增多有关。
我们在探讨Cur对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用的基础上，观察到20μmol/L Cur可部分抑制MPP+引起的PC12细胞Rh123荧光强度的下降，表明Cur可部分维持线粒体正常膜电位，稳定线粒体功能，此作用可能是Cur抑制MPP+诱导PC12细胞凋亡的作用机理之一。此外，本结果显示Cur可明显降低MPP+作用24h后细胞内ROS的含量，提示Cur对MPP+损伤PC12细胞的保护作用可能与其对ROS的清除作用有关。
【】
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