含何首乌血清对人胚肺二倍体成纤维细胞端粒酶活性的影响

             作者：李朝敢，韦星，农嵩，韦耀东，张树球  

【摘要】  目的 观察含何首乌血清对人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）超氧化物歧化酶(SOD)活性、c-myc mRNA表达及端粒活性的影响。方法 采用含何首乌血清对2BS细胞株进行处理，用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，RT-PCR检测c-myc mRNA表达，TRAP-ELISA检测端粒酶活性。结果 与正常对照组相比，用药组2BS细胞SOD活性明显增加（P<0.05），c-myc mRNA表达无变化，端粒酶活性显著增加（P均<0.05）。结论 含何首乌血清对2BS细胞具有抗衰老作用，其机理可能与促进自由基的清除和激活端粒酶活性有关。

【关键词】  首乌；血清；药；人胚肺二倍成纤维细胞；超氧化物歧化酶；c-myc；端粒，末端转移酶

　　Abstract:  Objective  To observe effects of Tuber Fleeceflower Root serum on activity of SOD, the expression of c-myc mRNA and the activity of telomerase of human fetal lung diploid fibroblasts (2BS).  Methods  2BS cell lines were treated with Tuber Fleeceflower Root serum. The activity of c-myc mRNA was detected by semi-quantitive RT-PCR. A TRAP-ELISA method was used to measure the telomerase activity.  Results  Compared with those in the control group, the activity of SOD increased obviously (P<0.05),  the expression of c-myc mRNA remained on the same level, and the telomerae activity were enhanced significantly(P<0.05) in the drug group.  Conclusion  Tuber Fleeceflower Root serum can postpone senescence of 2BS, its mechanism may be associated with enhancement elimination of free radicals and activation of telomerase.                         
   
　　Key words:  Tuber Fleeceflower Root; srum; pharmacology; human fetal lung diploid fibroblasts; superoxide dismutase; c-myc; telomerase 

　　何首乌又称首乌、赤首乌、乌肝石等，为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的块根，具有补肝肾、益筋血、壮筋骨、乌须发之功效。研究表明［1］，何首乌具有抗衰老、保护神经、增强免疫功能、降低血脂、抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血、保肝、抗癌、抗菌等作用。在正常体细胞中，由于端粒的缩短及缺乏端粒酶的表达，细胞逐渐衰老。仅有极少数的细胞因为端粒酶在某种因子的作用下偶然激活，持续合成端粒DNA序列使细胞绕过M2退化期，获得无限增殖能力，从而逃避了程序性老化。端粒酶活性的调节可为抗衰老的研究提供一条新途径［2］。本组研究何首乌血清药物对人胚肺二倍成纤维细胞（2BS）内超氧化物歧化酶(SOD)活性、c-myc表达及端粒酶活性的影响，以探讨其抗衰老的可能机理，为抗衰老药物的筛选及老年病的康复提供用药实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料 

　　1.1.1  细胞株  2BS由北京生物制品研究所提供的25代细胞系，以30代龄以下为年轻细胞，50代龄以上为老年细胞。

　　1.1.2  主要试剂和仪器  胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品， SOD检测试剂由南京建成生物技术有限公司提供，Trizol试剂盒为美国Invitrogen公司产品，RT-PCR试剂盒为Promega公司产品，PCR引物为上海生物工程公司合成，Telomerase PCR-ELISA试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品。KHB K3酶标仪(芬兰)，2700型PCR仪（ABI公司，USA）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  含药血清制备［3］  取健康家兔6只(由右江民族医学院动物实验中心提供)，随机分为空白对照组和用药组。用药组每天灌胃何首乌水煎剂（含生药）4.5g/kg，空白对照组灌胃蒸馏水，连续灌胃5天，采血前24h禁食，采血前再灌胃1次，每只家兔采血于无菌离心管中离心10min(3000r/min)，无菌分离血清，56℃灭活30min，过滤除菌，冻存备用。

　　1.2.2  细胞培养及分组  将2BS细胞于25ml培养瓶中培养，以含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液在37℃、5%CO2的培养箱中培养。细胞分组为：年轻组、空白血清对照组(简称对照组)和含何首乌药物血清组(简称用药组)。年轻组从25代开始用10% FBS的RPMI 1640培养液培养，传代至30代时收集细胞；取生长状态良好的35代细胞，消化传代，待细胞贴壁后，吸弃含FBS的培养液，换10%含药血清培养液，即含药血清组，同时换空白血清做对照，传代至51代后，收集细胞。

　　1.2.3  SOD活性测定  分别收集各组细胞，调整细胞数为1×106/ml，细胞反复冻融，使细胞胀破，离心取上清液用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，于550nm处测OD值。实验过程参照检测试剂盒说明书。

　　1.2.4  半定量RT-PCR检测基因表达  离心收集各组细胞，按Trizol试剂盒的说明书提取总RNA。内对照β-actin和c-myc引物借助primer premier 5.0软件设计，并经Genebank验证。β-actin引物：上游5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG-3′，下游5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3′，扩增产物长度621bp；c-myc引物：上游5′-CCA ACA GGA GCT ATG ACC TC-3′，下游5′-CTC GGT CAC CAT CTC CAG CT-3′，扩增产物为290bp片段。按试剂盒说明采用一步法进行RT-PCR。RT-PCR反应体系总体积50μl，逆转录45℃×45min，禽成髓性白血病病毒逆转录酶（AMV RT）灭活和预变性94℃×2min，然后进行PCR 35个循环（94℃×30s，57℃×1min，68℃×2min），最后延伸68℃×7min，终止于4℃。各取PCR产物10μl，加溴酚蓝指示剂2μl，于1.5%琼脂糖凝胶上电泳约1h（电压90V），用紫外透射分析仪观察结果。通过密度扫描仪扫描分析各条带的光密度，以β-actin的表达量为对照并比较各组c-myc的相对表达量。实验重复3次。

　　1.2.5  端粒酶活性检测  离心收集各组细胞。制备端粒酶抽提液和端粒重复序列扩增法-酶联免疫吸附试验（TRAP-ELISA）操作按照试剂盒说明书进行。以690nm作为参比波长，测定样品在450nm波长的吸光度(A)，吸光度差值△A=A450nm-A690nm，△A值代表细胞端粒酶活性。

　　1.2.6  统计方法  计量数据以±s表示，用SPSS11.5软件进行统计学分析，参数统计采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  各组2BS细胞SOD活性的检测结果  年轻组2BS细胞SOD活性明显高于对照组（P<0.05），用药组2BS细胞SOD活性明显高于对照组（P<0.001），见表1。

　　表1  各组2BS细胞SOD活性比较（略）

　　注:与对照组比较,a:t=4.093,P<0.05；b:t=8.122,P<0.001

　　2.2  各组2BS细胞c-myc mRNA的表达  各组2BS细胞c-myc mRNA相对表达量无明显变化（P>0.05），见图1和表2。

　　2.3  各组2BS细胞端粒酶活性的比较  年轻组2BS细胞端粒酶活性与对照组无明显变化（P>0.05），用药组2BS细胞端粒酶活性明显高于对照组（P<0.001），见表2。

　　3  讨论
    　　
　　何首乌主要含有蒽醌类化合物、二苯乙烯苷类化合物及聚合原花青素等，此外何首乌中还含有大量的卵磷脂和多种微量元素。二苯乙烯苷是何首乌的主要活性成分［4］。何首乌能延长二倍体细胞的生长周期；可明显降低老年小鼠脑和肝组织中丙二醛(MDA)含量，增加脑内单胺类递质水平，增加SOD 活性，还能明显抑制老年小鼠脑和肝组织内单胺氧化酶-B的活性，从而消除自由基对机体的损伤，延缓衰老和疾病的发生；能明显提高老年大鼠的外周淋巴细胞DNA损伤修复能力，调节中枢神经活动，延缓大脑的衰老［5～7］。

　　图1  RT-PCR检测c-myc基因mRNA表达（略）

　　M. DNA marker  1.年轻组  2.用药组  3.对照组

　　表2  各组2BS细胞c-myc mRNA表达和端粒酶活性比较（略）

　　注:与对照组比较,a:t=2.157,b:t=0.512,c:t=1.311,P均>0.05；d:t=12.082,P<0.001

　　有关衰老的自由基学说认为，衰老是自由基(主要是氧自由基) 对细胞成分的有害攻击造成，维持体内适当水平的抗氧化和自由基清除水平可以推迟衰老。正常情况下，体内有多种清除氧自由基的酶，能清除代谢过程中产生的氧自由基，主要有超氧化物歧化酶(SOD)，以及过氧化氢酶和过氧化物酶［8］。在本实验中用药组2BS细胞SOD含量高于对照组，表明何首乌药物血清在一定程度上促进细胞SOD的合成（或者是SOD的激活剂），从而使细胞增加抗自由基能力，延缓衰老过程。
    　　
　　研究表明，端粒和端粒酶在细胞复制性衰老中起着重要作用。端粒是真核细胞染色体末端的重复DNA序列，其生物学作用是防止染色体DNA降解、末端融合、非正常重组和染色体的缺失。由于存在“末端复制问题”，随着细胞老化，人体细胞端粒重复序列长度不断缩短，端粒缩短到一定长度，细胞就会停止分裂而走向衰老死亡。但端粒酶能够由自身的RNA提供模板，来维持与染色体稳定至关重要的端粒结构，使细胞具有无限繁殖的能力。如果在正常体细胞中重建端粒酶活性，就可维持细胞的端粒长度，延缓细胞的衰老［9］。端粒酶再激活被认为是细胞逃脱衰老的重要机制。本实验结果数据显示，用药组2BS细胞端粒酶活性明显高于对照组，提示何首乌药物血清通过激活端粒酶活性，维持细胞端粒长度或引起端粒缩短减慢，从而延缓细胞的衰老。
    　　
　　目前对端粒酶的激活途径还不完全清楚，从现有资料看，端粒酶的激活是一个多因子参与的多水平的调节过程，涉及转录水平调控、蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的磷酸化。其中myc构成了端粒酶激活途径的核心。研究发现［10］，myc激活端粒酶的确是通过上调端粒酶的催化亚单位TERT的mRNA表达水平来实现的。在原代培养的无端粒酶活性的乳腺上皮细胞和成纤维细胞中发现myc基因的表达产物可直接激活端粒酶，其活性可以达到肿瘤细胞中的水平。本实验结果发现，年轻组、用药组和对照组2BS细胞c-myc mRNA表达无明显变化，表明含何首乌血清激活端粒酶活性不是通过c-myc激活途径。
    　　
　　本实验结果证实：含何首乌药物血清对2BS细胞具有抗衰老作用，其机理可能与促进自由基的清除和激活端粒酶活性有关。但其确切机理有待进一步研究。

【】
  　　［1］ 孙桂波,纪凤兰,徐惠波,等.何首乌的化学成分与药理作用研究进展［J］.长春中医药大学学报,2007,23(4):105-106.

　　［2］ 宋昊岚.端粒酶与衰老及肿瘤［J］.肿瘤研究与临床，2000，12（1）：67-68.

　　［3］ 王筠，张军平.中药血清药实验方法研究概况［J］.天津中医药，2005，22（1）：86-88.

　　［4］ 孙桂波，纪凤兰，徐惠波，等.何首乌的化学成分与药理作用研究进展［J］.长春中医药大学学报，2007，23(4)：105-106.

　　［5］ 陈计，夏炎兴，杨秋美，等.何首乌吸收成分对大鼠二倍体细胞生长和传代的影响［J］.上海中医药杂志，1995，29(8)：41-42.

　　［6］ 杨秀伟.何首乌醇提物对易老化小鼠肝脏和脑单胺氧化酶活性的影响［J］.中药杂志，1996，21（1）：48-49.

　　［7］ 宋士军，李芳芳，岳华.何首乌的抗衰老作用研究［J］.河北医科大学学报，2003，24（2）：90-91.

　　［8］ 黄丹.细胞衰老的研究进展［J］.暨南大学学报：医学版，2001，22（6）：36-39.

　　［9］ Granger MP, Wright WE, Shay JW. Telomerase in cancer and aging ［J］. Crit Rev Oncol Hemat, 2002, 41（1）:29-40.

　　［10］ Greenberg RA, Hagan RCO, Deng HY, et al. Telomerase reverse transcriptase gene is a direct target of c-myc but is not functionally equivalent in cellular transformation ［J］. Oncogene,1999,18（5）:1219-1226.