干燥综合征患者唇腺p53及PCNA表达与其发生非霍奇金淋巴瘤的相关性研究
作者：莫汉有，周润华，王晓桃，莫东华，陈蓓莉，朱珊珊
【摘要】 目的 探讨p53及增殖细胞核抗原（PCNA）在原发干燥综合征(pSS)并发非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者唇腺中的表达及意义。方法 利用免疫组织化学方法分别检测正常人群、pSS、pSS并发NHL、NHL患者的p53及PCNA表达。结果 正常人群、pSS、pSS并发NHL、NHL患者的p53表达阳性率分别为5.26%，15.5%，90.90%和92.30%。PCNA表达阳性率分别为13.15%，27.80%，100.00%，96.15%。p53及PCNA表达阳性率在pSS并发NHL、NHL患者明显高于正常人群、pSS患者(P<0.01)，其强度亦明显增高。结论 p53及PCNA与pSS患者并发NHL的发生有关，可用于pSS患者并发NHL的潜能及预后评价。如pSS患者p53及PCNA表达阳性率升高，应积极予应用免疫抑制剂。
【关键词】 干燥综合征；淋巴瘤，非霍奇金；p53；增殖细胞核抗原；唇腺
Abstract: Objective To outline the significance of P53 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expressions in labial gland in patients with primary Sjogren’s syndrome (pSS) associated with Non-Hodgkin’s Lymphoma (NHL). Methods An immunohistochemical method was used to detect the expression of P53 and PCNA in tissue samplesfrom normal subjects，patients with pSS，patients with pSS associated with NHL，and patietns with NHL，respectively. Results The positive expression of P53 were found with rates of 5.26%，15.5%，90.90% and 92.30% in normal subjects，patients with pSS，patients with pSS associated with NHL，and patients with NHL，respectively；and the positive expression of PCNA was13.15%，27.80%，100.00% and 96.15%，respectively.Comparing to normal subjects and patients with pSS，the positive expression of P53 and PCNA in patients with pSS associated with NHL and patients with NHL were higher (P<0.01).A deep color was also found in staining. Conclusion P53 and PCNA are involved in the genesis and development of NHL in patients with pSS.They can be used as predictors for potentiality and prognosis of pSS associated with NHL.If the expression of PCNA and P53 increased in patients with pSS，we should adopt immunosuppressant actively.
Key words: Sjogren’s syndrome；Non-Hodgkin’s Lymphoma；P53 protein；proliferating cell nuclear antigen；labial gland
原发干燥综合征（primary Sjogren’s syndrome，pSS）是一种由淋巴细胞介导的主要累及外分泌腺的全身性自身免疫性疾病，其特征性病理改变为唾液腺和泪腺等外分泌腺组织淋巴细胞浸润，腺体组织进行性破坏，致使腺体功能减退或丧失［1］。pSS与肿瘤的关系较为密切，尤其非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)多见。与性别、年龄相匹配的正常人群比较，其发生NHL的相对危险率为正常人群的44倍［2］。而其并发NHL的发病机理目前还不十分清楚，本组采用免疫组织化学染色技术检测pSS患者唇腺组织中p53及增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平，以期初步探讨pSS患者高发NHL的发病机理。
1 资料与方法
1.1 临床资料 2002年以前病例按照1992年制定的pSS欧洲诊断标准，2002年以后病例按照2002年修订的pSS国际分类标准［3，4］。选择经我院风湿科、口腔科、眼科、病理科1997年1月～2005年7月间确诊的241例pSS患者的唇腺活检标本，术前均未接受激素及免疫抑制剂治疗。本组男72例，女169例，年龄35～81岁，平均52岁。并发NHL 11例中，男5例，女6例，年龄46～72岁，平均60岁；分类为边缘区淋巴瘤3例，滤泡性淋巴瘤3例，弥漫性大B细胞淋巴瘤2例，套细胞淋巴瘤1例，间变性大细胞淋巴瘤1例，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤1例。正常人群选择我院既往下唇外伤标本8例，另外30例为有口干症状但唇腺病理正常、血清学阴性者标本。NHL患者选用既往确诊患者石蜡切片共52例，其中边缘区淋巴瘤7例，滤泡性淋巴瘤21例，弥漫性大B细胞淋巴瘤12例，套细胞淋巴瘤6例，间变性大细胞淋巴瘤3例，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤2例，结外NK/T细胞淋巴瘤1例。标本均经40%的甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚5μm。
1.2 实验方法
1.2.1 p53检测 采用SABC法，试剂盒购自博士德生物工程公司，p53单克隆抗体为丹麦DAKO公司产品，稀释度1∶50。以PBS替代一抗作为阴性对照，光镜下阳性反应为细胞核着棕黄色，着色浅者为（+），着色深者为（++），不着色者为（-）。
1.2.2 PCNA 检测 采用免疫组化法，PCNA抗体为DAKO公司产品，稀释度1∶100。室温下孵育1h，采用3-氨-9，2基咔唑（AEC）进行显色反应，所有标本免疫反应及显色反应在同一时间，同一条件下进行。细胞核出现棕黄色颗粒者为阳性，阳性细胞数<25%为（+），25%～50%为（++），51%～75%为（+++），>75%为（++++）。
1.3 统计学处理 用SPSS11.5软件进行统计分析，实验数据用x±s表示。计量资料组间比较采用独立样本t检验或t′检验，两个变量相关分析用pearson相关分析。
2 结果
2.1 4组标本中p53的表达 38例正常人唇腺标本中腺泡上皮p53表达阳性者2例，阳性率为5.26%。241例pSS患者唇腺标本中p53表达阳性37例，阳性率为15.35%。pSS患者p53表达阳性37例中10例并发NHL，发生时间为6～93个月。pSS患者p53表达阴性204例中并发NHL仅1例。11例pSS并发NHL患者标本中p53表达阳性10例，阳性率为90.90%。52例NHL患者标本中p53表达阳性48例，阳性率为92.31%。pSS并发NHL及NHL患者p53表达阳性率与正常人群及pSS患者相比，差异有高度显著性(P<0.01)。而pSS患者并发NHL与NHL患者p53表达阳性率差异无显著性（P>0.05），见表1～表3。
2.2 四组标本中PCNA的表达 PCNA阳性产物呈颗粒状散在分布于胞质和胞核内，着色深浅不一。本组38例正常人群唇腺标本腺泡上皮PCNA阳性者5例，表达阳性率为13.15%。241例pSS患者标本中PCNA阳性者67例，表达阳性率为27.80%。这67例阳性者中11例并发NHL，发生时间为6～93个月。241例pSS患者标本中PCNA阴性者174例无一例并发NHL。11例pSS并发NHL患者标本PCNA均为阳性，表达阳性率为100%。52例NHL患者标本中PCNA阳性者50例，表达阳性率为96.15%。pSS并发NHL、NHL患者PCNA表达阳性率明显高于正常人群及pSS患者，两者相比差异有高度显著性（P<0.01），且表达强度亦明显增高。p53、PCNA的阳性表达与并发NHL有关(P<0.001)。以上见表2、表3。正常人群PCNA阳性产物分布与着色程度与pSS患者表达阳性细胞相似。而pSS并发NHL患者阳性细胞中，着色颗粒更多集中于细胞核内，较密集，染色较深，与NHL患者相似。见表2、表3。
表1 p53在四组标本中的表达（略）
a与c比较：χ2=29.36，a与b比较：χ2=67.37，b与c比较：χ2=34.76，b与d比较：χ2=122.99，P均<0.01；c与d比较：P=1.00
表2 PCNA在四组标本中的表达（略）
a与c比较：χ2=25.44，a与b比较：χ2=63.64，b与c比较：χ2=22.39，b与d比较：χ2=83.31，P均<0.01；c与d比较：P=1.00
表3 p53、PCNA表达阳性者并发NHL的比较（略）
3 讨论
pSS是一种以外分泌腺高度淋巴细胞浸润为特征的慢性自身免疫性疾病，其基本病理特点为淋巴组织的增生和对各部位的浸润。一般认为，当淋巴细胞浸润局限于外分泌腺时，构成临床上口及眼的干燥征。pSS患者淋巴结通常不增大，一旦出现显著的淋巴结病变说明已进入恶变前状态(即所谓的假性淋巴瘤)。假性淋巴瘤被认为是自身免疫性疾病与恶性淋巴瘤的中间状态，腺体外表现有发热，淋巴结病变，脾肿大，肺部浸润，淋巴结内不规则的多克隆淋巴网状增生是其组织学特点。当淋巴细胞出现恶性病变时即形成恶性淋巴瘤，也就是NHL。其中以非霍奇金B细胞淋巴瘤最为多见，少数为T淋巴瘤。而其与性别、年龄相匹配的正常人群比较，其发生NHL的相对危险率为正常人群的44倍。pSS并发恶性肿瘤的机理目前仍不十分清楚，但其所引发的肿瘤为多因素所致已成共识。推测其可能的因素有：①患者由于CD4/CD8比例失调，抑制性T细胞功能相对不足，使B细胞过度增生，部分克隆进而恶变为淋巴瘤；另一方面由于T细胞免疫监视功能的下降，不能及时清除体内突变或癌变的细胞株而易并发其他肿瘤［4］；②持续或反复的抗原刺激使免疫细胞发生恶性增生而导致肿瘤的发生；③pSS与肿瘤可能具有某些共同的病因和病理基础；某些致病因子在诱发pSS的同时可能激活癌基因，而癌基因的激活与表达对pSS并发肿瘤可能具有重要的起始作用。p53基因是一种抑癌基因，野生型p53基因蛋白产物抑制DNA合成和复制，从而抑制细胞增殖。而突变型p53蛋白由于构象发生突变，其正常p53功能消失，对细胞转化和增殖起促进作用［5］。目前大量研究表明，p53在基因突变和恶性肿瘤的发生、发展有密切关系，其在恶性肿瘤的表性率明显高于良性和非恶变组织。有报道在结肠腺瘤中p53蛋白检出率为70%，在喉鳞癌中为64%。提示p53蛋白核内聚集可能在肿瘤发展为恶性、表现侵袭性之前出现与癌前病变发展为癌有关。而本组研究结果显示pSS患者p53表达阳性者其合并NHL明显高于p53表达阴性者(P<0.001)。PCNA为非组蛋白核蛋白，是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，为DNA复制所必需。PCNA从细胞增殖周期G1期开始出现在细胞核内，S期最为明显。因此，免疫组化方法显示PCNA表达阳性细胞是处在DNA合成期细胞，即分裂增殖状态的细胞，在细胞增殖和转化中，其量变化程度反映了细胞生物活性，可用于良、恶性肿瘤的鉴别及预后评估。本组研究结果显示，pSS患者PCNA表达阳性者并发NHL明显高于PCNA表达阴性者（P<0.001）。综上所述，对干燥综合征进行p53、PCNA检测，有助于量化其恶变潜能，为早期遏制其恶变提供指导。如干燥综合征p53、PCNA检测呈阳性，应早期应用免疫抑制剂以早期遏制其向NHL发展。
【】
［1］ Zhang NZ，Shi CH，Yao QP，et al.Prevalence of Sjogren’s syndrome in People Republic of China ［J］.J Rheum，1995，22：659.
［2］ 张乃峥.临床风湿病学［M］.上海：上海技术出版社，1999.229-230.
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［5］ Batsakis JG，EJ-Naggar AK.P53：Fifteen years after discovery ［J］.Advon in anato Pathol，1995，(2)：71.
