循环中内皮祖细胞与原发性高血压的关系
作者：蓝景生，黄照河，潘兴寿，王小庆，罗初凡，杨燕华
【摘要】 目的 探讨循环内皮祖细胞(EPCs)数量和功能与原发性高血压的关系。方法 对34例初诊原发性高血压患者以及30例健康人采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板，培养7天后，收集贴壁细胞，多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs，流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPCs，倒置荧光显微镜下计数。采用MTT比色法、改良的Boyden小室、粘附能力测定实验分别观察EPCs的增殖能力、迁移能力、粘附能力。结果 原发性高血压患者循环中EPCs数量比前明显减少（P<0.01），降压达标后原发性高血压患者EPCs数量增加，但与对照组相比，达标后原发性高血压患者EPCs数量仍然少(P<0.05)。原发性高血压患者EPCs的增殖、迁移、贴壁能力受损(P均<0.01)；降压达标后的原发性高血压患者EPCs的增殖、迁移、贴壁能力受损没有完全恢复(P均<0.01)。结论 原发性高血压患者循环EPCs数量减少，功能受损；血压增高是循环EPCs数量和功能改变的原因之一，循环EPCs数量和功能的改变可能还参与原发性高血压的发生和。
【关键词】 高血压，原发性；内皮细胞；病理过程；生理过程
Abstract： Objective To study the relationship between circulating endothelial progenitor cells (EPCs) and essential hypertension. Methods 34 patients with primary diagnosed as essential hypertension and 30 healthy individuals were involved in this study.Mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation.EPCs were characterized as adherent cells double positive staining for DiI-acLDL uptake and lectin binding with using fluorescent microscope，EPCs proliferation and migration were assayed by MTT assay and modified Boyden chamber assay，respectively，EPCs adhesion assay was performed by replating cells on fibronectin-coated dishes，then counting the adhesion cells with inverse microscope. Results The number of circulating EPCs in patients with essential hypertension was significantly reduced in comparison to treatment before (P<0.01)，an elevated EPCs were obtained in patients after the blood pressure was controlled.While compared to control group，the number of EPCs was still lower (P<0.05).In addition，EPCs proliferative，migratory and adhesive capacity in patients with essential hypertension show senescence (P<0.01) and they recovered to some degree after the patients blood pressure were controlled (P<0.01). Conclusion The present findings suggested that circulating EPCs be impaired in essential hypertension patients，and circulating EPCs may be involved in the mechanism of essential hypertension.
Key words： hypertension，primary; endothelial cell; pathological processes; physiological processes
最近研究提示［1，2］：血管内皮祖细胞的数量和功能受损与心血管的危险因素呈负相关，尽管高血压是一个重要独立的心血管的危险因素，但原发性高血压与血管内皮祖细胞的关系尚未阐明。本组观察初诊原发性高血压患者及其降压达标后循环内皮祖细胞数量和功能的变化，探讨循环内皮祖细胞数量和功能与原发性高血压的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2005年4月～2006年1月在中山大学附属第一门诊和住院诊疗的患者，根据2004年高血压防治指南初诊单纯原发性高血压患者34例，排除高脂血症、糖尿病、冠心病、脑血管病等其他合并症，经降压治疗后有29例达标，在治疗前和降压达标后1个月测定循环内皮祖细胞数量和功能。以30例年龄相匹配的健康人为对照组。
1.2 方法
1.2.1 内皮祖细胞的鉴定与计数 自肘前静脉采集外周血标本并置于EDTA管抗凝。循环内皮祖细胞定义为表达CD34+的单个核细胞，且单个核细胞体外培养，荧光显微镜鉴定FIT C-UEA-I和DiI-acLDL双染色阳性细胞为内皮祖细胞。采用FIFC标记的具有高亲和力的鼠抗人CD34单克隆抗体(美国 Pharmingan公司)与采集的血样本共育15min以标记CD34+细胞。应用流式细胞仪(Elite，Beckman-Counter 美国)计数CD34+细胞数目。将单个核细胞接种在包被有纤维连接蛋白的培养板，DMEM培养基培养1周，将细胞与DiI-acLDL(10μg/ml)37℃孵育1h，以检测内皮祖细胞对DiI-acLDL的摄取。然后用2%多聚甲醛固定10min，将FITC-UEA-I(10μg/ml) 加入上述标本37℃孵育1h，激光共聚焦显微镜鉴定UEA-I和DiI-acLDL 双染色阳性细胞为内皮祖细胞。
1.2.2 内皮祖细胞增殖能力试验 如上述方法搜集贴壁细胞并计数。再将等量EPCs接种到包被有人纤维连接蛋白96孔培养板，每孔加10μl MTT(5g/L)，培养4h后，吸弃上清液，再加入二甲基亚砜(150μl/ml)，于微量振荡器充分振荡10min，置酶标仪于波长490nm测A值。
1.2.3 内皮祖细胞迁移能力 如上述方法搜集贴壁细胞并计数。将VEGF和25μl培养液加入改良的Boyden小室的下室，将2×104EPCs悬浮在50μl培养液注入上室，培养24h，刮去滤膜上面的未移动细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，随机选择3个显微镜视野(×200)计数迁移到低层的细胞。
1.2.4 内皮祖细胞粘附能力检测 用0.25%胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，悬浮在500μl培养液并计数，然后再将EPC接种在包被有人纤维连接蛋白的培养板在 37℃培养30min，计数贴壁细胞。
1.2.5 统计学处理 计量数据以x±s表示，数据分析采用t检验和方差分析。
2 结果
2.1 内皮祖细胞的鉴定与数量 分离获得的单个核细胞培养7天后形成了梭形的内皮样细胞(见图1)。用acLDL-DiI和FITC-UEA-Ⅰ对细胞染色后，通过共聚焦显微镜鉴定，UEA-Ⅰ和DiLDL双染色阳性细胞确认为正在分化的EPCs(见图2)。并在倒置荧光显微镜下计数15个随机选择的高倍(×200)视野EPC。与对照组相比，原发性高血压患者循环中内皮祖细胞数量明显减少(34.4±4.7 vs 62.8±9.3，t=6.49，P<0.01);与治疗前相比，降压达标后原发性高血压患者内皮祖细胞数量增加，但与对照组相比，达标后原发性高血压患者内皮祖细胞数量仍然少(34.4±4.7 vs 43.5±5.1 vs 62.8±9.3，F=4.83，P<0.05)。
图1 A、从外周血分离出 的单个核细胞在倒置显 微镜下呈圆形(×200)。 B、培养7天后，洗掉 非贴壁细胞，贴壁细 胞呈梭形的内皮样细胞。（略）
图2 A1～3为高血压患者；B1～3为对照组正常人；C1～3为降压达标后的高血压患者。单个核细胞培养7天后，通过共聚焦显微镜鉴定细胞与凝集素结合（绿色，激发波长477mm）和DiLDL摄取（红色，激发波长543 mm），双染色阳性细胞（黄色）是正在分化的EPC，高血压组细胞较对照组明显减少，降压达标后高血压患者细胞稍增加（×400）。（略）
2.2 原发性高血压患者内皮祖细胞增殖能力的改变 与对照组相比，原发性高血压患者外周血EPC增殖能力明显受损(0.328±0.055 vs 0.531±0.061，t=3.11，P<0.01) ；与治疗前相比，降压达标后原发性高血压患者内皮祖细胞增殖能力有所恢复(0.328±0.055 vs 0.423±0.046 vs 0.531±0.061，F=2.84，P<0.01)。
2.3 原发性高血压患者内皮祖细胞迁移能力的改变 与对照组相比，原发性高血压患者外周血EPC迁移能力明显受损(6.4±3.7 vs 26.3±6.2，t=7.75，P<0.01)；与前相比，降压达标后原发性高血压患者内皮祖细胞迁移能力有所恢复(6.4±3.7 vs 17.6±4.4 vs 26.3±6.2，F=3.69，P<0.01)。
2.4 原发性高血压患者内皮祖细胞粘附能力的改变 与对照组相比，原发性高血压患者外周血EPC粘附能力明显受损(17.4±4.2 vs 33.1±5.1，t=5.70，P<0.01)；与治疗前相比，降压达标后原发性高血压患者内皮祖细胞粘附能力有所恢复(17.4±4.2 vs 23.9±4.5 vs 33.1±5.1，F=3.48，P<0.01)。
3 讨论
血管内皮祖细胞是一种多能干细胞，来源造血干细胞和循环中的单个核细胞，能增殖分化成血管内皮细胞，是尚未表达成熟的血管内皮细胞表型。内皮祖细胞不仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程。内皮损伤后的修复过程除了原先存在的邻近成熟内皮细胞的出芽或迁移，最近的研究表明［3～5］，也可通过内皮祖细胞分化为成熟内皮细胞参与修复损伤的内皮细胞。
外周血内皮祖细胞数量减少和功能受损与心血管的危险因素有关，Hill等［6］研究了45例具有心血管危险因素但没有患心血管疾病患者外周血EPC数量变化，对冠心病危险因素多变量回归分析中观察到：血胆固醇水平与EPC数量成反相关。同时，他们也观察到EPC数量与低密度脂蛋白胆固醇水平有反向线性趋势，但未达到统计学意义，另有报道［7］冠心病患者EPC数量和低密度脂蛋白胆固醇水平呈反向线性关系，且高胆固醇血症患者迁移能力受损。
Imanishi等［8］的动物实验和临床研究表明，原发性高血压大鼠和脱氧皮质酮乙酸盐—盐大鼠血中 EPC 数量减少和功能受损，37例原发性高血压患者血中 EPC 数量亦减少和功能受损，同时血中 EPC 数量减少和功能授损和端粒酶活性下降有关。
本组结果提示，原发性高血压患者血中EPC数量减少和功能受损，这与Imanishi等的临床研究结果一致。同时本组还发现，降压达标后血中EPC数量有所回升功能受损有所恢复，但与健康人相比，EPC数量减少和功能受损依然有统计学意义。这可推测血压增高可导致循环中EPC数量减少和功能受损，单纯降压并不能完全恢复EPC的数量和功能。血管内皮祖细胞可能参与原发性高血压发病的多个环节。这也许可解释：尽管目前高血压的治疗和预防有长足的进步，高血压控制率的提高并没有相应一致地减少由高血压导致的靶器官损害。
EPC参与原发性高血压的机理，可能与下列因素有关：①内皮功能障碍；②刺激血管平滑肌细胞增殖；③促进血栓形成；④降低NO的利用度等［9，10］。
【】
［1］ Urbich C，Dimmeler S.Risk factors for coronary artery disease，circulating endothelial progenitor cells，and the role of HMG-CoA reductase inhibitors ［J］.Kidney Int，2005，67(5)：1672-6.
［2］ Steiner S，Schaller G，Puttinger H，et al.History of cardiovascular disease is associated with endothelial progenitor cells in peritoneal dialysis patients ［J］.Am J Kidney Dis，2005，46(3)：520-8.
［3］ Loomans CJ，DAO HH，van Zonneveld AJ，et al.Is endothelial progenitor cell dysfunction involved in altered angiogenic processes in patients with hypertension ［J］.Curr Hypertens Rep，2004，6(1)：51-4.
［4］ Kalka C，Masuda H，Takahashi T，et al.Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeuticneovascularization ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(7)：3422-3427.
［5］ Vasa M，Fichtlscherer S，Adler K，et al.Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease ［J］.Circulation，2001，103(24)：2885-2890.
［6］ Hill JM，Zalos G，Halcox JP，et al.Circulating endothelialprogenitor cells，vascular function，and cardiovascular risk ［J］.N EnglJ Med，2003，348(7)：593-600.
［7］ Walter DH，Rittig K，Bahlmann FH，et al.Statin therapy accelerates reendothelialization： a novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells ［J］.Circulation，2002，105(25)：3017-3024.
［8］ Imanisihi T，Moriwaki C，Hano T，et al.Endothelial progenitor cell senescence is accelerated in both experimental hypertensive rats and patients with essential hypertension ［J］.J Hypertens，2005，23(10)：1831-1837.
［9］ Zhao YD，Courtman DM，Deng Y，et al.Rescue of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension using bone marrow-derived endothelial-like progenitor cells： efficacy of combined cell and eNOS gene therapy in established disease ［J］.Circ Res，2005，96(4)：442-50.
［10］ Touyz RM，Schiffrin EL.Reactive oxygen species in vascular biology： implications in hypertension ［J］.Histochem Cell Biol，2004，122(4)：339-352.
