赖氨酰氧化酶基因在动脉粥样硬化血管壁中的表达

                   作者： 金春延，宋京郁  ，任香善，刘双萍

【关键词】  蛋白赖氨酶6-氧化酶;动脉粥样硬化;细胞外基质

      ［摘要］ ［目的］ 观察赖氨酰氧化酶基因（LOX）在动脉粥样硬化血管壁中的表达情况. ［方法］ 选取动脉粥样硬化（ATS）尸检标本，采用LOX抗体免疫组织化学染色方法观察LOX在ATS血管壁平滑肌细胞、胶原和弹性纤维等有形成分中的表达、分布及生物学行为与ATS的关系. ［结果］ LOX在动脉粥样硬化组织内呈阳性表达，其阳性例数为24例（68.6%），阴性为11例（31.4%）. ［结论］ LOX在保持细胞外基质（ECM）的完整性中起重要作用，在ATS病变血管壁中有一定程度的表达，LOX活性的异常可导致ECM重建，从而可能促进ATS的形成.

    ［关键词］  蛋白赖氨酶6-氧化酶;动脉粥样硬化;细胞外基质

    ABSTRACT:OBJECTIVE To study the expression of lysyl oxidase gene（LOX）in atherosclerotic artery.METHODS Using autopsy specimen of atherosclerosis（ATS）and LOX antibody.It was observed and studied that the expression，distribution and biological activities of LOX in smooth muscle cells，collagen and elastin of atheromatous vascular wall and the relationship between LOX and pathological changes of ATS by immunohisto-chemistry.RESULTS The LOX was expressed in atherosclerotic artery，and total positive cases of LOX were24（68.6%），in which11（31.4%）were negative，respectively.CONCLUSION LOX plays a important role in maintaining the structural integrity of ECM，expresses in the arterial wall of ATS，and abnormal LOX activities may contribute to the pathogenesis of ATS by remodeling the ECM.Key words:protein lysine6-oxidase;atherosclerosis;extracellular matrix

    动脉粥样硬化（atherosclerosis，ATS）是危害人类生命健康的疾病之一，而细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在ATS的形成和过程中起重要作用 ［1］ .赖氨酰氧化酶基因（lysyl oxidase gene，LOX）位于第5号染色体，原位杂交显示在5q23.3～31.2 ［2］ .在人类胎盘、皮肤和主动脉ECM中，LOX与弹性蛋白和胶原纤维缔合.在发生ATS的动脉中，赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LO）可调节动脉中纤维成分的积聚 ［3］ .本文探讨了LOX在发生ATS血管的平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）、胶原和弹性纤维等有形成分上的表达、分布及生物学行为与ATS发生、发展过程中形态学之间的关系，为临床预防与ATS提供理论依据.

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 标本  选取45例延边地区不同年龄（25～66岁）病理尸检标本，其中35例为ATS标本，10例为阴性对照标本，均从主动脉和冠状动脉不同病变特点的粥样病灶中取材，用100g/L中性甲醛固定.

　　 1.1.2 试剂  LOX抗体由美国Hawaii大学Matrix 病理生物学科Charles D.Boyd及Katalin Csiszar教授惠赠.ABC试剂盒及DAB（3-3-二氨基联苯二胺盐酸盐）分别购自美国Vector公司及北京中山试剂公司.

    1.2 方法

    1.2.1 HE染色  按常规进行.

    1.2.2 Van Gieson染色（胶原纤维染色）  常规脱蜡移至蒸馏水，用Wigert铁苏木素液染色20min，流水冲洗，5g/L盐酸酒精迅速分化（短于30s），流水冲洗15～20min直至变为蓝色，蒸馏水冲洗3次，用Van Gieson液染色5min，950mL/L酒精分化20～30s，脱水，透明，封固（中性树胶）.

    1.2.3 Verhoeff铁苏木素染色（弹性纤维染色）  常规脱蜡移至蒸馏水，用Verhoeff铁苏木素液染色20～30min，颜色呈黑色为止，流水冲洗5min，蒸馏水涮洗3次，以20g/L三氯化铁水溶液分色至弹性纤维清晰（10～20s），流水冲洗5min，蒸馏水涮洗3次，用950mL/L酒精洗去碘色，使弹性纤维更加清晰，水洗，用Van Gieson液作对比染色（短于20s），500mL/L酒精迅速分色（20～30s），无水乙醇脱水，透明，封固（中性树胶）.

    1.2.4 免疫组织化学染色  实验操作按Vector ABC试剂盒说明书进行.因无已知阳性对照标本，故每次设阴性对照，以PBS代替一抗作阴性对照.免疫组织化学染色结果判定根据染色反应强度，并按其阳性细胞的数量及染色深度分别记分为0～3分，再根据这两项指标的积分数分为4级，具体如下:阴性（-）得0分，弱阳性（+）得2分，阳性（）得3分，强阳性（）得4分;阳性细胞数少于50%得1分，50%～80%得2分，高于80%得3分;染色的深度以多数细胞的呈色反应判定 ［4］ .

    2 结果

    2.1 ATS病变  所有标本HE染色观察结果表明，动脉壁均可见不同程度ATS病变的形成，即内皮下见大量泡沫细胞排列为层状，形成脂质斑块，VSMC增生显著，内弹力板断裂，粥样斑块丘状隆起凸向内 腔，丘状隆起的表层形成纤维帽，其下为脂质及组织

    坏死崩解物质（图1），并可见中膜SMC向泡沫细胞移行;Van Gieson染色观察结果表明，ATS病灶内可见大量泡沫细胞和呈红色染色的胶原纤维的形成（图2）;Verhoeff铁苏木素染色观察结果表明，在ATS病灶内可见呈黑色的弹力纤维增多，弹力板分离、断裂甚至消失（图3）.

    2.2 LOX在动脉壁中的表达与分布  LOX抗体免疫组织化学染色呈棕褐色的阳性颗粒主要分布在SMC和内皮细胞胞浆内（图4）.本组35例ATS标本中LOX阳性表达例数为24例（68.6%），其中强阳性为6例，显色为强棕褐色，阳性为7例，显色为次强棕褐色，弱阳性为11例，显色为棕褐色;阴性为11例（31.4%），不显色.

     3 讨论

    LO是铜依赖性胺氧化酶，可通过在某些赖氨酸和羟基赖氨酸中ε-氨基组的催化氧化去氨基作用使胶原蛋白和弹性蛋白交叉连接 ［5］ .LO作为胶原和弹性蛋白交联的关键酶与动脉粥样硬化性疾病及动脉瘤的形成有关联.LOX产生和活性的调节在保持ECM结构的完整性中起重要作用，而LOX活性的改变引起的细胞外基质重构可引起人类动脉疾病 ［6］ .体内无处不在的ECM不但可将各种细胞连接在一起，保持各种组织及器官基本形状，而且可维持力学性质.胶原在ECM中含量最高，刚性及抗张强度亦最大，是构成ECM的骨架结构.胶原通过对VSMC增殖的调节，与ATS的形成相关，特别是Ⅰ型及Ⅲ型胶原的增生在ATS病变进展过程中作用尤为突出 ［7］ .弹性蛋白与脂质沉积有密切关系，脂质饱和的弹性蛋白对弹性蛋白酶降解的敏感性增加.本实验中观察到，ATS标本血管壁ECM中LO的表达较少见，但在内皮细胞及SMC内LO的表达率较高.LO活性特异性位点的改变与疾病模型血管的分布和严密性相关，在ATS模型中LO活性的明显增加表明这种ECM酶活性是ATS中纤维化易感性接近的指标.总之，LOX在保持ECM的完整性中起重要作用，在ATS病变血管中有一定程度的表达，它的活性异常可导致ECM重建，从而促进ATS 的形成. 

　 ［参 考 文 献］

    ［1］ 宋京郁，孙东植，尹正日.Carneu白鸽血管壁细胞外基  质的改变伴有自发性动脉粥样硬化的发生［M］. 中华医学研究精览文库内科卷（上册） .北京:军事医学出版  社，2000.740.

    ［2］ Hamalainen ER，Jones TA.Molecular cloning of human  lysyl oxidase and assignment of the gene tochromosome5q23.3～31.2［J］.Genomics，1991，11（3）:508.

    ［3］ Katya R，Lynda I，Mungo S.Upregulation of lysyl oxi- dase in vascular smooth muscle cells by cAMP:role for adenosine receptor activation［J］.Journal of Cellular Biochemistry，1999，75:177.

    ［4］ 王江，倪灿荣.P53、ras、c-erbB-2癌基因产物在大肠癌和大肠息肉中的表达［J］. 中华病杂志 ，1994，4: 97.

    ［5］ Hamalainen ER，Kemppainen R，Kuivaniemi H.Quanti- tative polymerase chain reaction of LO mRNA in malig-nantly transformed human cell lines demonstrate that their low LO activity is due to low quantities of its mRNA and low levels of transcription of the respective gene［J］. J Biol Chem，1995，270:21590.

    ［6］ Song YL，Ford JW，Gordon D.Regulation of lysyl oxi- dase by interferonr in rat aortic smooth muscle cells［J］Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000，20:982.

    ［7］ Murata K，Motoyama T，Kotake C.Collagen types invarious layers of the human aorta and their changes with the atherosclerotic process［J］.Atherosclerosis，1986，60:251.