重组人干扰素α2a凝胶剂的制备

          作者：张淑子 ，张京兰 ，董义兰

［摘要］ ［目的］ 制备重组人干扰素α2a凝胶剂，并研究部分药效和毒. ［方法］ 以羧甲基纤维素钠为基质制备重组人干扰素凝胶剂，利用FL传代细胞检测凝胶在体外培养单纯疱疹病毒（HSV）的抑制作用，并进行家兔体内局部用药毒性试验及稳定性试验. ［结果］ 所制备重组人干扰素α2a凝胶剂的稳定性良好，局部用药未见皮肤刺激反应及急性毒性反应，对HSV-Ⅱ的抑制效果优于对HSV-Ⅰ. ［结论］ 所制备重组人干扰素α2a具有制备工艺简单、稳定性好及无毒副作用等特点，且对HSV有抑制作用.

　　［关键词］  干扰素α，重组;凝胶;药物，评估

    ABSTRACT:OBJECTIVE To prepare rhIFNα2a gel and study on its effectiveness and toxicology.METHODS CMC-Na was used as the gel base，the pharmacological effects of anti-HSV in vitro was studied with FL cell，the toxicity in topical administration was tested with animals and the stability test was performed.RESULTSThe gel was stable，no skin stimulation and acute toxicity was found，and its antiviral effects on HSV-Ⅰwas better than on HSV-Ⅱ.CONCLUSION The preparation technique of rhIFNα2a gel is simple，and the gel is stable in quality and nontoxic，and that can inhibit HSV effectively.

    Key words:interferon alfa，recombinant;gels;drug evaluation

    干扰素具有抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖及调节机体免疫功能等作用，有多种剂型应用于临床.国内外有众多关于将干扰素注射于皮肤损伤部位或局部应用的报道 ［1］ ，如将干扰素α软膏用于人类乳头状瘤病毒感染的尖锐湿疣 ［2］ ，将干扰素α乳膏用于治疗生殖器疱疹 ［3］ ，将干扰素α口服剂用于治疗人类乳头状瘤病毒感染的口腔黏膜病变等 ［4］ ，均获得了良好的效果.本研究制备了重组人干扰素α2a外用凝胶剂，旨在为局部应用以达到治疗目的提供依据.

    1 材料与方法

    1.1 材料  WISH细胞及水疱性口炎病毒（VSV）由药品生物制品检定所提供;HSV-Ⅰ型和HSV-Ⅱ型购自中国医学院病毒研究所;FL人羊膜传代细胞和白色健康家兔（体重为2～3kg，雌雄各半）由卫生部长春生物制品所提供;IMDM购自GIBCO公司;重组人干扰素α2a原液由长生基因药业公司制备;羧甲基纤维素钠及甘油对羟基甲酸乙酯等试剂均为分析纯.

    1.2 制备  处方为干扰素1.8×10 7 U，羧甲基纤维素钠4.0g，甘油16.0g，对羟基苯甲酸乙酯0.1g，人血白蛋白0.3g，加蒸馏水至90mL.制备方法:取处方量羧甲基纤维素钠、甘油、对羟基苯甲酸乙酯及适量蒸馏水混和均匀，高压灭菌（115℃，30min），冷却至适宜温度，加入人血白蛋白及干扰素溶液，加蒸馏水至90mL，缓缓搅拌成凝胶状，分装于药用铝管内，每支为12g（10mL），干扰素含量为2.0×10 5 U/mL，共制备3批样品，生产批号分别为051001，051102，051103.

　　1.3 稳定性试验

    1.3.1 加速试验  采用温度与湿度联合加速试验方法，即将干扰素凝胶样品放入含有饱和氯化钠（相对湿度为74.7%）的干燥器内，再置于（40±1）℃恒温培养箱中培养，分别于1，2，3月时取样进行外观、效价及微生物限度等相关质量指标检查.

    1.3.2 离心稳定性试验  取3批样品各5mL，分别置于10mL离心试管中，以4000r/min离心30min，观察凝胶剂的外观及涂展性的变化情况.

　　1.4 抗病毒试验  参照［5］的方法进行，即培养FL细胞至单层，向试验组内加入干扰素凝胶稀释液0.1mL、HSV病毒液0.1mL及细胞维持液0.8mL，向对照组内加入HSV病毒液0.1mL及细胞维持液0.9mL，待细胞出现明显病变时反复冻融3次，低速离心，取上清液测定其TCID 50 .病毒滴定采用微孔板滴定方法进行，即将样品梯度稀释后，分别加样0.1mL于各孔，置于37℃，50mL/L二氧化碳孵箱内培养，7d后样品对病毒的抑制效价.

    1.5 局部用药毒性试验

　　1.5.1 局部刺激性试验  取健康家兔20只，随机分为5组，即3批样品试验组、赋型剂对照组及空白对照组，每组各为4只.家兔背部去毛5.0cm×5.0cm，同时进行破损皮肤试验.分别给予3批样品试验组家兔皮肤破损部位涂抹相应批次重组人干扰素α2a凝胶1g，每日2次;给予赋型剂对照组家兔涂抹相同剂量的不含干扰素的基质，每日2次;空白对照组不予处理.

    1.5.2 急性毒性试验  取健康家兔20只，雌雄各半，分组方法同1.5.1项下方法.家兔背部去毛5.0cm×5.0cm，同时进行破损皮肤试验.分别给予3批样品试验组家兔皮肤破损部位涂抹相应批次重组人干扰素α2a凝胶5g，;给予赋型剂对照组家兔涂抹相同剂量的不含干扰素的基质;空白对照组不予处理;自给药之日起每日进行观察，连续15d.

    2 结果

    2.1 3批样品质量指标检测结果  由表1可见，3批样品的相关质量指标检测结果均符合要求.表1 3批重组人干扰素α2a凝胶样品的质量指标检测结果批次干扰素效价

　　 2.2 稳定性试验  重组人干扰素α2a凝胶在（40±1）℃，相对湿度为75%的条件下储存3个月后微生物限度、性状、澄明度及效价等各项指标均在合格范围内（表2）.留样观察结果表明，干扰素凝胶在4℃条件下可保存2年，效价未见下降，且外观及微生物限度检查均合格;在25℃保存2年，效价仍保存在80%～85%范围内，见表3.离心稳定性试验结果示，离心后凝胶剂内气泡被除去，无分层及沉淀现象，仍呈透明及均匀状，且涂展性良好，提示离心稳定. 表2 加速试验干扰素效价测定结果

    2.3 抗病毒试验  由表4可见，干扰素凝胶对HSV-Ⅰ，HSV-Ⅱ的抑制效价分别大于103.0，104.0，提示干扰素凝胶对病毒有较强的抑制作用，而对HSV-Ⅱ的抑制作用优于对HSV-Ⅰ.表4 干扰素凝胶对病毒的抑制效价

    2.4 毒性试验

    2.4.1 局部刺激性试验  各试验组家兔单次给药后即时，24，48h分别观察及多次给药后每日观察皮肤反应情况时未见红斑及水肿出现，提示本品对皮肤无刺激性.

    2.4.2 急性毒性试验  实验观察期间，各试验组家兔的体重、皮肤、毛发及四肢活动未见异常，一般状态良好.

    3 讨论

    将干扰素应用于病毒感染性疾病时，有全 身给药和局部给药途径.全身给药即肌肉注射给药后常出现不良反应;而局部给药即局部注射、涂抹及纱布帖敷，其中局部注射给予干扰素时有强烈疼痛感，使患者难以忍受.将干扰素制备成各种外用剂型，直接应用于患病局部，不仅可使病变部位干扰素浓度升高，抑制病毒生长繁殖，而且亦可使非感染细胞迅速处于抗病毒状态，提高细胞免疫功能及防御病毒侵袭的能力，从而达到治疗目的 ［6］ .本文根据病毒性皮肤病特点 ［7］ ，按照《药剂学》 ［8］ 及《药典》中的有关凝胶剂的要求，结合干扰素生物学特性，制备了干扰素α2a凝胶剂.综上所述，本研究所制备的干扰素α2a凝胶剂具有稳定可靠，无刺激性，对HSV抑制作用强，涂抹后无不适感，制备工艺简单，成本低廉等特点.

    ［参 考 文 献］

    ［1］ Hengge UR，Benninghoff B，Ruzicka T，et al..Topicalimmunomodulators-progress towards treating inflamma-tion，infection，and cancer［J］.Lancet Infect Dis，2001， 1（3）:189.

    ［2］ Shi XL.The clinical application of interferons in dermato- logic disorders［J］.J Bio，2001，18（6）:29.

    ［3］ Pang CC，Jiang LX，Bai L，et al..Recombinant humanalpha-2b interferon in cream for treatment of genital her-pes and herps zoster［J］.Journal of Dalian Medical Uni-versity，2003，25（3）:185.

    ［4］ Barnard DL.Interferon-alpha.amarillo biosciences［J］.Curr Opin Investig Drugs，2002，3（5）:693.

    ［5］ Zhang JT.Modern experimental methods in pharmacolo-gy［M］.Beijing:Beijing Medical University Press，1998.1427.

    ［6］ He WS.Curative effect of laser combined withα-interfer-on on point condyloma［J］.Modern Hospital J，2004，4（6）:208.

    ［7］ Wang GC.Dermatology［M］.Vol2.Beijing:People Health Press，1992.82.

    ［8］ Bi DZ.Pharmaceutics［M］.Vol4.Beijing:People Health Press，2000.378.