BALB/c小鼠黑色素瘤B16移植肿瘤模型的建立

【摘要】  ［目的］建立宜于进行早期观察及测量的小鼠黑色素瘤模型［方法］将不同数量的处于对数生长期的B16细胞株黑色素瘤细胞接种于BALB/c小鼠背部及足垫皮下，建立移植肿瘤动物模型.观察小鼠肿瘤的生长特点，应用病和免疫组织化学染色方法进行鉴定，归纳接种细胞数与肿瘤发生率的关系及肿瘤生长对小鼠生活状态的影响［结果］接种5d后BALB/c小鼠皮肤浅表部位相继出现黑色的点或线状改变，为结节状改变直至肿瘤破溃、出血、死亡或破溃、出血、结痂、愈合，部分小鼠出现肿瘤消退.在接种细胞数大于5×105个时BALB/c小鼠的肿瘤模型全部建立成功［结论］B16细胞株黑色素瘤细胞接种于BALB/c小鼠的肿瘤模型成功率与接种细胞数成正比，它具有建立肿瘤模型成功率高，观察及测量方便等优点，接种部位以背部皮下为宜.

【关键词】  黑色素瘤 模型 动物 小鼠

    ABSTRACT:OBJECTIVETo establish neoplasm transplantation models of melanoma in BALB/c miceMETHODSB16 melanoma cells in logarithmic growth phase were inoculated into BALB/c mice's back hypodermis and feet with different concentration to establish neoplasm transplantation of melanoma. The growth characteristics of transplanted melanoma in mice were observed and the tumor properties were identified by histopathology and immunohistochemistry. The relations between the number of B16 cells inoculated and tumorigenetic rate, and the influence of tumorigenesis for mice were observedRESULTSFive days later, black spots and linear changes were gradually seen in BALB/c mice's back skin, feet or ankle, and then they developed to tubercles, ulceration, hemorrhage and death. The tumorigenetic rate in inoculating with 5×105  B16 cells was near 100%CONCLUSIONThe tumorigenetic rate has a positive relation to the number of inoculated B16 cells, and is high in BALB/c mice inoculated the B16 cells into back hypodermis.

    Key words:melanoma;models, animal;mice

    恶性黑色素瘤是来源于黑色素细胞的恶性肿瘤，是起源于神经嵴的黑色素细胞恶性肿瘤［1］，近年来发病率呈逐年上升的趋势，目前尚无有效的方法［2，3］.本实验通过给接种不同数量的黑色素瘤细胞，建立了便于早期观察的黑色素瘤动物模型，并筛选出最佳接种细胞数及接种部位，为进一步进行黑色素瘤的治疗实验研究奠定基础.

    1  材料与方法

    1.1  材料  实验动物取清洁级近交系BALB/c小鼠，购于军事医科大学实验动物中心，雄性，6，7周龄，体重为17～19g.仪器：二氧化碳细胞培养箱（MCO?17AC）为日本SANYO公司产品.试剂：S?100抗体及S?P试剂盒分别为美国Santa Cruz公司及ZYMED公司产品.

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  B16黑色素瘤细胞株购于上海细胞生物研究所，常规培养于RPMI?1640 100mL/L胎牛血清加双抗（青霉素100U/mL，链霉素100mg/L）的培养液内，置于37℃，50mL/L二氧化碳培养箱中培养.稳定传代3，4代后，取对数生长期细胞，经2.5g/L胰酶消化后用无血清培养液重悬收集细胞，用无菌生理盐水调整细胞密度备用.用台盼蓝染细胞确定活细胞数在95%以上.

    1.2.2  小鼠背部皮下肿瘤模型的建立  取BALB/c小鼠24只，随机分为3个组，每组各为8只，用750mL/L质量浓度的乙醇消毒小鼠背部皮肤，取B16黑色素瘤细胞溶液接种于小鼠背部皮下，第1，2，3组的接种细胞数分别为1×1010/L，5×109/L，1×109/L，接种剂量为0.1mL.每日观察并记录肿瘤生长情况.

    1.2.3  小鼠足垫肿瘤模型的建立  取BALB/c小鼠24只，随机分为3个组，每组各为8只，用750mL/L质量浓度的乙醇消毒小鼠足垫部皮肤，取B16黑色素瘤细胞溶液接种于小鼠足垫皮下，3个组接种细胞数分别为1×1010/L，5×109/L，1×109/L，接种剂量为50μL.每日观察并记录肿瘤生长情况.

    1.2.4  观察指标  观察肿瘤出现时间与肿瘤生长速度，接种后每日观察小鼠背部及足垫部皮肤，将出现黑色斑点的时间记为肿瘤出现时间，同时记录肿瘤外观形态、颜色、小鼠体重及生活习性的改变等情况.

    1.2.5  病理学检查  按照常规将肿瘤组织制成石蜡切片，行苏木精?伊红染色，在光学显微镜下进行观察；免疫组织化学观察采用S?P法.

    2  结果

    2.1  小鼠背部皮下肿瘤模型  接种B16黑色素瘤细胞株后小鼠体重均呈上升趋势，生活习性未见改变.接种5d后，第1，2组小鼠均相继出现蓝黑色斑点或斑片，其中第1组小鼠肿瘤在接种后第11～15日时处于快速生长期，之后变为相对缓慢，第16日后其中2只小鼠的肿瘤开始缩小，直至触摸不清，仅能观察到皮肤表面蓝黑色斑片，1只小鼠在病情中出现双目不睁症状，另有2只小鼠随结节状肿瘤增大，出现肿瘤破溃、出血、结痂、死亡；第2组小鼠在接种后第7～18日时肿瘤生长迅速，于第19日处死1只小鼠进行病理检查；第3组小鼠中在接种后第11日时6只相继出现蓝黑色斑点或斑片，肿瘤生长一直缓慢，第15日时1只小鼠的肿瘤开始缩小，触摸不清，直至消失，1只小鼠肿瘤出现转移，体重下降，活动减少，呆滞，死亡（图1）.背部皮下肿瘤的特点为表皮出现蓝黑色的斑点或斑片，边界清楚，皮毛无明显减少；隆起的肿物由硬至软直至触摸不清或由硬至软再至硬直至肿瘤破溃、出血及结痂形成.第1，2，3组的肿瘤发生数分别为8，8，5只.

    2.2  小鼠足垫肿瘤模型  接种B16黑色素瘤细胞株后小鼠体重呈上升趋势，生活习性未见改变.接种5d后，第1组小鼠足垫均相继出现点或线状改变，随肿瘤生长，小鼠接种同侧踝部均出现前述改变，第15～22日时肿瘤处于快速生长期，肿瘤增大，隆起呈结节状，继而出现破溃、出血及结痂形成（图2），其中1只小鼠肿瘤缩小，有1只的肿瘤向上生长至大腿部位，瘤体巨大，死亡；第2组小鼠中于接种后7d时，6只小鼠足垫相继出现黑色斑点或线状改变，10d后2只小鼠出现踝部转移灶，第16～30日时肿瘤快速生长，其中1只小鼠的结节状肿瘤出现溃烂及出血，体重下降，活动减少，呆滞，1只小鼠肿瘤逐渐减少直至消失；第3组小鼠中接种后第12日时3只的足垫部相继出现点或线状改变，且肿瘤的生长速度较其他2个组相对缓慢.足垫肿瘤的特点为肿瘤首先出现在接种部位或同侧踝部，外观呈黑色点或线状改变，随着肿瘤的生长，部分出现同侧踝部转移；肿瘤隆起呈结节状，出现破溃、出血、结痂及溃烂.第1，2，3组小鼠的肿瘤发生数分别为8，5，3只.

    2.3  病检查  在光学显微镜下见黑色素瘤细胞呈巢状分布，细胞大小不一，胞浆丰富，核有异型性，可见较多的病理性核分裂，部分细胞变性伴有不规则坏死，细胞内外可见大小不一的黑色素颗粒（图3），免疫组织化学S?100染色呈阳性（图4）.图1  BALB/c小鼠背部皮下肿瘤模型(接种后第15日)图2  BALB/c小鼠足垫下肿瘤模型(接种后第25日)                            图3  BALB/c小鼠背部皮下恶性黑色素瘤组织  ×400图4  肿瘤细胞S?100染色  ×400

    3  讨论

    可移植性肿瘤模型是目前应用最为广泛的肿瘤模型［4］，优点是接种一定数量的肿瘤细胞后可使一群实验动物带有同一种肿瘤，生长速度较一致，个体差异较小，接种成功率可达100%；对宿主的影响类似，易于客观地判断疗效.一般来说，小鼠的移植性实验肿瘤都是自发性肿瘤或诱发性肿瘤，一部分自发或诱发的小鼠肿瘤，经传代后可保持其原有的特性，就成为移植性肿瘤.在实验肿瘤学研究中，最有利用价值的是近交系小鼠［5］，而C57小鼠为近交系动物，其B16黑色素瘤模型具有肿瘤发生率高及模型易建立等优点，但C57小鼠本身为黑色小鼠，给黑色素瘤的观察和穿刺接种等带来不便，且它繁殖能力较低，生长周期也较长，不容易获得，因此C57小鼠更适合于B16黑色素瘤的保种.BALB/c小鼠亦是近交系动物，且毛色为白色，具有生产性能好、繁殖期长及对致癌因子敏感等特点.据报道，用肿瘤组织主动免疫动物时，可促进体内移植性肿瘤的生长［6］.本实验结果表明，B16黑色素瘤在BALB/c小鼠肿瘤发生率与接种细胞数成正比，在接种细胞数多于5×105个时肿瘤模型全部建立成功，而且当小鼠体表出现点或线状黑色或蓝黑色改变时即可记为肿瘤出现时间，故BALB/c小鼠在肿瘤的接种及观察过程中操作简便.本实验中出现了死亡的小鼠，其原因可能为瘤体巨大，导致衰竭死亡.本实验见小鼠背部皮下肿瘤的形态特点为在发展过程中的肿瘤存在包膜，所以在早期呈现为边界清楚的硬结，随后肿瘤实体中心发生液化及坏死，继而变软被周围组织吸收，留下黑色斑块，部分肿瘤继续向周围浸润生长，导致肿瘤向皮肤表皮层生长及突破，出现肿瘤破溃.本研究中亦可见，小鼠足垫容积过小，注射肿瘤细胞悬液后部分小鼠出现注射部位渗液，还有部分小鼠在肿瘤的生长过程中过早地出现瘤体破溃，不利于肿瘤的测量，还有在足垫皮下接种肿瘤细胞后，部分小鼠出现黑色素瘤体改变的部位首先是同侧踝部，其原因可能为小鼠足垫皮下血管丰富、细小，接种过程中损伤毛细血管，肿瘤细胞发生转移所致.总之，B16细胞株黑色素瘤细胞接种于BALB/c小鼠建立移植肿瘤模型成功率与接种细胞数成正比，具有建立肿瘤模型成功率高，观察及测量方便等优点，接种部位以背部皮下为宜.

【】
  ［1］ Dennis LK. Analysis of the melanoma epidemic， both apparent and real：date from the 1973 through 1994 surveillance， epidemiology， and end results program registry［J］.Arch Dermatol，1999，135（3）：275.

［2］ Stone A,　Cooper J, Koening KL, et al..A comparison of survival rates for treatment of melanoma metastatic to the brain［J］.Cancer Invest,2004,22(4):492.

［3］ Tsao H, Atkins MB, Sober AJ.Management of cutaneous melanoma［J］.N Engl J Med,2004,351(10):998.

［4］ 潘海涛，杨述华，刘勇，等.可移植性鼠骨肉瘤肿瘤模型的建立［J］.中华医学杂志，2005，29（6）：471.

［5］ 管敏强.近交系动物遗传检测［J］.青海畜牧兽医杂志，2006，36（5）：48.

［6］ 孙靖中，邹雄.肿瘤分子生物学［M］.北京：人民出版社，1998.181