PCR产物靶向克隆法构建pET15b?CAT及His?tag?CAT融合蛋白的表达与纯化

                作者：王家宁, 郭凌郧, 谭艳, 郑飞, 孔霞, 黄永章

【摘要】  目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT) cDNA 的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b?CAT,并表达和纯化出His?tag?CAT融合蛋白。 方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。以pZeoSV2(+)?CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增。 将纯化的人CAT cDNA PCR产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b以6∶1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25 ℃反应30 min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b?CAT。重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定。pET15b?CAT转化BL21(DE3)宿主菌，用IPTG诱导表达出His?tag?CAT融合蛋白，采用Ni2+?NTA树脂进行亲和层析。 结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b?CAT。SDS?PAGE和Western blot结果表明，转化了pET15b?CAT的宿主菌表达出了His?tag?CAT融和蛋白，经Ni2+?NTA树脂亲和层析得到了纯化的His?tag?CAT，并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶的活性，活性值为80.23 U/g。结论:采用PCR产物靶向克隆法成功地构建了pET15b?CAT,并表达和纯化出了His?tag?CAT融和蛋白，为采用外源性CAT防治与氧化应激损伤相关性疾病奠定了基础。

【关键词】  过氧化氢酶;聚合酶链反应;靶向克隆；原核表达；组氨酸标签

    Abstract：Objective To clone human catalase (CAT) cDNA PCR product into pET15b?CAT to generate recombinant plasmid pET15b?CAT and express and purify His?tag?CAT fusion protein. Methods A pair of PCR primers having 15 bases of homology with sequences flanking the desired site of insertion in the cloning vector were designed. The plasmid pZeoSV2(+)?CAT was used as the template for amplification of human CAT cDNA for PCR cloning. The purified human CAT cDNA and the linearized pET15b with XhoⅠ and BamHⅠ digestion was mixed together at a molar ratio of 6:1 within the tube containing recombinant enzyme in total volume 20μL and incubated at 25 ℃ for 30 minutes, then transformed the reaction product into competent DH5α. The prokaryotic expression vector was identified with PCR, XhoⅠ digestion and DNA sequencing. The recombinant plasmid pET15b?CAT was  transformed into BL21(DE3) host bacteria which was induced with IPTG. The recombinant protein His?tag?CAT was purified with affinity chromatography on a Ni2+?NTA?resin column. Results Homologous recombination occurred between PCR product human CAT cDNA and linearized pET15b. Human CAT cDNA was successfully inserted into pET15b to generate pET15b?CAT. SDS?PAGE and Western blot demonstrated successful expression and purification of His?tag?CAT fusion protein with specific activity of 80.23 U/g. Conclusion The prokaryotic expression vector pET15b?CAT has been constructed successfully with PCR cloning reaction. The successful expression and purification of His?tag?CAT fusion protein provides a basis for prevention and therapy of various disorders related to oxidative stress.

    Key words：Catalase;Polymerase chain reaction;Targeting cloning;Prokaryotic expression;His?tag

    活性氧(包括·O2-,·OH,H2O2等)所致的氧化应激与200多种人类疾病的病理生理过程有关[1]。细胞防御体系利用抗氧化酶如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)来对抗活性氧的毒性作用[2]。SOD催化·O2-产生H2O2,而CAT和GPx则将H2O2降解为H2O和O2,并避免

    ·OH基团的产生[3]。长期以来人们希望利用外源性抗氧化酶防治各种氧化应激损伤。本研究采用PCR产物靶向克隆法构建了原核表达载体pET15b?CAT， 以说明PCR产物靶向克隆法构建重组质粒的优越性。将原核表达载体pET15b?CAT转化宿主菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达出N末端带有6个组氨酸标签的CAT融和蛋白His?tag?CAT,采用镍柱螯和亲和层析对其进行纯化，从而成功制备出了His?tag?CAT,为利用外源性CAT防治氧化应激损伤奠定了基础。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  主要仪器:PCR扩增仪（Biometra，德国），透射式紫外分析仪（EF?90A，上海），凝胶成像系统（Touching 955 gel document system，上海），台式高速冷冻离心机（Hettich，Universal 32 R，德国），超声波细胞破碎仪(JY?98?3D,宁波),超速冷冻离心机(Hitachi,HimacCP80MX,日本),核酸蛋白检测仪(HD?2004B,上海),恒流泵(HL2,上海),紫外分光光度计（Cecil 2041，英国）。

    1.1.2  主要试剂:Taq DNA聚合酶，dNTP,200 bp DNA ladder marker和λDNA/Hind Ⅲ marker购自北京华美转导科技有限公司;XhoⅠ，BamHⅠ购自New England Biolabs公司;Lp Recco PCR Cloning Kit购自广州隆湃尔生物科技有限公司;Advantage 2 PCR Enzyme system购自Clontech公司;低熔点琼脂糖购自Promega公司;预染蛋白分子量标准购自北京赛百盛生物工程公司,Ni2+?NTA树脂为Novagen公司产品;His?probe(G?18)购自Santa Cruz Biotechnology公司;ECL化学发光试剂盒为Amersham Pharmacia Biotech公司产品;CAT试剂盒购自南京聚力生物医学工程研究所。用于靶向克隆的PCR产物扩增的引物和用于鉴定重组质粒的PCR引物均由北京赛百盛生物工程公司合成。

    1.1.3  质粒与菌株:模板质粒pZeoSV2(+)?CAT由美国西奈山医学院生化/药系白景香博士惠赠，质粒pET15b和大肠杆菌BL21(DE3)购自Novagen公司，大肠杆菌DH5α由本临床医学研究所提供。

    1.2  方法

    1.2.1  PCR扩增目的片段:根据GenBank中登录号为“AY028632”的人CAT cDNA的序列设计合成扩增CAT cDNA的引物，为了使扩增的目的片段与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切后的线性化pET15b载体发生同源重组反应，在扩增目的片段的上、下游引物的5'端分别加入与载体线性化位点两侧序列同源的15个碱基。为了恢复重组后载体的XhoⅠ、BamHⅠ位点，在上游同源序列的3′端加入一个碱基G，在下游同源序列的3′端加入一个碱基C。上游引物为5′CAG CCA TAT GCT CGA G ATG GCT GAC AGC CGG GAT 3′，下游引物为5′GTT AGC AGC CGG ATC C TCA CAG ATT TGC CTT CTC 3′，均为34 bp(—表示与载体线性化位点同源的序列,斜体表示酶切位点,…表示扩增CAT cDNA 的引物)。以pZeoSV2(+)?CAT为模板，PCR扩增两端分别与XhoⅠ、BamHⅠ酶切后线性化的载体pET15b有15个碱基的同源序列的人CAT cDNA全长。PCR反应体系：10×Advantage 2 PCR buffer 10 μL，10×dNTP 10 μL，10×上下游引物各10 μL，Advantage 2 polymerase mix 2 μL，模板pZeoSV2(+)?CAT 2 μL，补加去离子水至100 μL。循环参数：95 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，30个循环；68 ℃ 3 min。取10 μL PCR产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，证实扩增出预期的1 584 bp的片段后，将剩余的PCR产物采用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收用于靶向克隆。

    1.2.2  pET15b的XhoⅠ、BamHⅠ酶切:取载体pET15b进行XhoⅠ、 BamHⅠ酶切。先用XhoⅠ对pET15b酶切过夜，然后进行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后用适量去离子水溶解，将回收的经XhoⅠ酶切的pET15b载体，再经BamHⅠ酶切，然后采用0.8％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收线性化的载体用于靶向克隆。

    1.2.3  克隆反应:将扩增的PCR产物人CAT cDNA与经过XhoⅠ、BamHⅠ酶切的载体按6∶1摩尔数之比加入PCR克隆反应混合液中，加去离子水至总体积20 μL，25 ℃ 30 min，65 ℃ 热灭活30 min，置于冰上留作转化用。

    1.2.4  重组质粒的转化及提取:从-80 ℃超低温冰箱取出100 μL感受态DH5α，取4 μL PCR克隆反应产物加入感受态DH5α中，轻弹管壁，使其均匀分布，置冰上30 min，42 ℃热休克90 s，加入SOC培养基400 μL，37 ℃水浴 225 r/m振摇，取100 μL铺于含100μg/mL Ampicillin的LB平板上,置37 ℃细菌培养箱中过夜，挑取单克隆用LB培养基扩增，用碱裂解法小量提取质粒后用于鉴定。待鉴定正确后，大量扩增质粒备用。

    1.2.5  pET15b?CAT的鉴定:⑴PCR扩增鉴定：采用针对人CAT cDNA序列（881～900）bp的上游引物（5'TTA ATC CAT TCG ATC TCA CC 3'）和针对CAT cDNA序列（1 071～1 090）bp的下游引物（5'GGC GGT GAG TGT CAG GAT AG 3'）进行PCR扩增鉴定。扩增条件为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物应为209 bp。⑵XhoⅠ的酶切鉴定：根据人CAT cDNA序列在1 143位点有一个XhoⅠ识别序列及pET15b 5'端的XhoⅠ位点，进行XhoⅠ酶切后，应出现1 143 bp的片段。⑶测序鉴定：将大量提取的质粒pET15b?CAT分装20 μL至1.5 mL Eppendorf管，送往北京华大中生科技有限公司测序。测序采用T7 promoter通用引物。

    1.2.6  pET15b?CAT转化宿主菌BL21（DE3）和His?tag?CAT融合蛋白的诱导表达:将表达质粒pET15b?CAT转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌，转化的菌液铺于含Ampicillin(100 μg/mL)的LB平板上，37 ℃温箱培养待长出菌落。挑单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，37 ℃振摇培养过夜，然后用新鲜培养基按1∶50比例稀释，扩大培养至OD600≈0.8时加入终浓度为1.0 mmol/L 的IPTG，30 ℃培养24 h以诱导目的蛋白表达。4 ℃，5 000 r/min离心5 min,收集细菌沉淀,1×PBS漂洗3次,加50 mL结合缓冲液(5 mmol/L 咪唑, 500 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris.HCl,pH 7.9)重悬菌体。然后冰浴状态下超声破菌(800 W,30 min,每超声5 s间隔15 s),将菌液置超速冷冻离心机中20 000 r/min离心10 min后,则融合蛋白以天然、可溶的形式存在于上清中。

    1.2.7  His?tag?CAT融合蛋白的纯化:pET15b作为载体所表达的基因工程重组蛋白在其N端带有一个由6个组氨酸组成的“标签”（His?tag），可用Ni2+?NTA树脂柱进行亲和层析纯化。收集超离后的上清，将其转入装有Ni2+?NTA树脂的层析柱中,上样完毕后静置2 h，以便6个组氨酸标签与填料中Ni2+充分结合。分别用10倍柱体积的结合缓冲液和6倍柱体积的漂洗缓冲液（30 mmol/L咪唑,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris.HCl,pH 7.9）过柱以洗去未结合的杂蛋白，然后用洗脱缓冲液（500 mmol/L咪唑,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris.HCl,pH 7.9）将His tag?CAT融合蛋白洗脱下来。收集峰值洗脱液行SDS?PAGE和Western blot检测蛋白表达水平及纯化效果。洗脱的蛋白加入10%甘油后用生物半透膜透析48 h以充分脱盐（透析液为pH 7.4的PBS,含10%甘油）。纯化的融合蛋白用0.22 μm的滤膜除菌后，分别用1.5 mL Eppendorf管分装，－20 ℃保存备用。

    1.2.8  12％SDS?PAGE和Western blot检测:制备相应浓度的分离胶和浓缩胶，分别取含有目的蛋白的细菌裂解上清（纯化前）和收集的峰值洗脱液（纯化后）行SDS?PAGE电泳（150 V、25 mA、2 h）,凝胶用考马斯亮蓝R?250染色40 min后，用含10％冰醋酸和10％甲醇的脱色液脱色至本底无色为止，经凝胶成像系统扫描，可得出目的蛋白的相对分子质量及占全部菌体蛋白的百分含量。

    融合蛋白His?tag?CAT经SDS?PAGE分离后行Western blot以进一步证实纯化产物。将凝胶电转印至硝酸纤维素膜上,1×TBS/0.2％戊二醛固定40 min，加10 mL封闭液封闭1 h阻断非特异性结合部位，加入1∶1 000稀释的一抗（兔抗组氨酸多克隆抗体）10 μL，室温振摇孵育过夜。Western漂洗液漂洗3次，加10 mL封闭液及按1∶1 000稀释的羊抗兔二抗10 μL，水平摇床孵育1 h后漂洗3次，加1 mL化学发光剂，置入暗室用X光胶片曝光，然后显影，定影。

    1.2.9  蛋白浓度测定:采用Bradford法[4]进行蛋白浓度定量（以BSA作为标准对照）。

    1.2.10  融合蛋白的酶活性检测:用紫外分光光度计测定230 nm时H2O2的消失即可反映过氧化氢酶活性。1单位酶活性定义为：25 ℃，pH 7.0时，每分钟分解1 μmol/L H2O2所需的酶量。活性检测按试剂盒说明书进行。

    2  结果

    2.1  用于靶向克隆的编码人CAT cDNA的扩增结果

    以pZeoSV2(+)?CAT质粒为模板，经用于靶向克隆于pET15b的XhoⅠ、BamHⅠ位点的人CAT cDNA上下游引物扩增后，行1.0％琼脂糖凝胶电泳，可见预期的1 584 bp大小的片段（见图1）。图1  PCR扩增的人CAT cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果

    1  λDNA/Hind Ⅲ marker;

    2  PCR amplification of human CAT cDNA(1 584 bp)

    2.2  pET15b?CAT的PCR扩增鉴定

    采用进行鉴定的PCR上下游引物进行扩增，行2％琼脂糖凝胶电泳，结果发现扩增出了预期的209 bp的扩增片段（见图2）。

    图2  pET15b?CAT的PCR扩增鉴定

    1  200 bp DNA ladder marker;

    2  PCR amplification of pET15b?CAT(209 bp)

    2.3  pET15b?CAT的XhoⅠ酶切鉴定

    根据pET15b和人CAT cDNA 1143位点处各有一个XhoⅠ识别序列，对提取的质粒进行XhoⅠ酶切过夜后，行1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果发现出现了预期的1 143 bp大小的片段（见图3）。

    2.4  pET15b?CAT的测序分析

    将上述经限制性酶切分析和PCR鉴定的重组质粒进行核苷酸序列测定。分析证实人CAT cDNA序列成功地定向插入到载体pET15b的XhoⅠ、BamHⅠ位点，其序列与GenBank中登录号为“AY028632”的人CAT cDNA序列完全一致（图4）。

    2.5  His?tag?CAT融合蛋白的表达和纯化

    将质粒转化基因工程菌E.coli.BL21(DE3)，经IPTG诱导蛋白表达后，用氮基三乙酸（NTA）共价固定的含Ni2+树脂进行金属螯合层析来纯化His?tag?CAT融合蛋白。分别取含有目的蛋白的细菌裂解上清（纯化前）及收集的峰值洗脱液（纯化后）行SDS?PAGE，68KD附近可见目的蛋白的表达条带，且融合蛋白高水平表达成为E.coli中总蛋白的主要成分，应用Ni2+?NTA树脂纯化的蛋白纯度达90％左右（图5）。用兔抗组氨酸多克隆抗体行Western blot，显示为单一印迹，无降解条带，说明在工程菌BL21中得到了His?tag?CAT的可溶性表达，且目的蛋白在表达过程中无降解（图6）。

    2.6  酶活性检测

    用紫外速率测定法进行活性检测。结果表明，纯化的His?tag?CAT蛋白具有特异的CAT酶活性，其活性值为80.23 U/g。

    3  讨论

    基因重组技术是分子生物学中常用的方法，是研究基因功能的基本手段。但在基因重组中经常会出现插入的目的基因片段与载体的酶切位点不相匹配，致使基因重组出现困难。为解决酶切位点不匹配的情况，人们常采用平端连接，但是平端连接的操作步骤多，连接效率低，背景较高以及需要鉴定正反向插入等缺点[5]。为了实现定向插入的目的，人们对PCR产物进行TA载体克隆，即在扩增目的基因片段的上下游引物5'端分别引入与载体相适应的酶切位点，然后利用Taq DNA聚合酶非模板依赖性末端转移酶的活性，在dATP存在的情况下，在扩增片段的3'端加入单个碱基“A”，依据T/A互补原理将目的基因片段插入到T载体上，扩增后再采用相应的限制性酶切进行下一轮亚克隆到所需的载体[6-8]。

    人CAT cDNA编码区含有一个XhoⅠ和3个BamHⅠ位点，若在扩增人CAT cDNA的上下游引物5'端分别引入XhoⅠ、BamHⅠ，扩增的片段克隆入T载体后，在下一轮亚克隆至pET15b XhoⅠ、BamHⅠ位点时出现困难，因为XhoⅠ、BamHⅠ酶切后会导致人CAT cDNA编码区不完整，无法表达出完整的具有功能的蛋白质。尽管姚玲玲等[9,10]采用同尾酶技术，在扩增人CAT cDNA上下游引物的5'端分别引入SalⅠ、BglⅡ位点，利用SalⅠ与XhoⅠ、BglⅡ与BamHⅠ互为同尾酶，酶切后能产生相同粘性末端并通过碱基互补作用，将CAT cDNA片段插入到pET15b的XhoⅠ、BamHⅠ位点。但同尾酶技术破坏了载体的原有酶切位点，使重组质粒的鉴定出现困难。

    为克服上述困难，本研究采用PCR产物靶向克隆法成功构建了原核表达质粒pET15b?CAT。PCR产物靶向克隆能否成功的关键在于引物的设计。为了实现扩增的CAT cDNA片段与XhoⅠ、BamHⅠ酶切后的线性化载体pET15b实现靶向克隆的同源重组反应，在扩增人CAT cDNA上下游引物的5'端分别加入与载体XhoⅠ、BamHⅠ线性化位点两侧15个碱基的同源序列；为了恢复同源重组后载体上的XhoⅠ、BamHⅠ位点，分别在上下游引物与载体同源序列的3'端分别加入1个“G”和1个“C”。

    本研究中采用了Advantage 2聚合酶混合物进行CAT cDNA的扩增。Advantage 2聚合酶混合物包括核酸酶缺陷的N末端删除的Taq DNA聚合酶，少量proofreading polymerase和自动热启动的TaqStart 抗体。该混合物中的Taq DNA聚合酶的敏感性高，PCR产量高，适合扩增较大片段的目的基因。proofreading聚合酶具有3'→ 5'的外切酶功能，可以及时将误掺的碱基删除，保证扩增的忠实性（fidelity）。TaqStart抗体可以避免在初始热循环变性之前的非特异性扩增，而在变性之后TaqStart 抗体灭活后Taq酶又完全恢复活性，大大提高了PCR的特异性。因此采用Advantage 2聚合酶混合物扩增目的片段保证了扩增反应的敏感性、特异性和忠实性。

    采用靶向克隆酶，可以识别PCR产物和线性化载体的两端同源序列，并将PCR产物置换到目标载体上从而发生同源重组。在这一过程中，为了提高同源重组率，目的基因和目标载体的比例要合适，二者的摩尔数之比一般(3～9)∶1较好，在本研究中采用的插入片段与线性化的载体pET15b的摩尔数之比为6∶1,重组反应一次成功。若目的基因与目标载体的摩尔数之比偏低，易致靶向克隆的背景偏高。

    PCR产物靶向克隆法构建重组质粒具有以下优点：⑴适用于任何载体，插入片段，酶切位点；⑵只要线性化载体就行（单酶切、双酶切均可）；⑶不用连接酶；⑷不用载体的去磷酸化；⑸反应混合物25 ℃温育30 min即可，节省了时间和精力；⑹可以实现靶向克隆，避免了鉴定正反向插入的麻烦；⑺插入的目的基因从起始密码子序列开始，没有两端多余的序列，不影响后续基因的表达；⑻重组效率高；⑼重复性好，可靠性好；⑽无需末端抹平。本研究采用PCR产物靶向克隆法构建了pET15b?CAT，大大缩短了实验周期，提高了成功率，避免了传统克隆方法难以克服的困难。

    PCR产物靶向克隆法构建重组质粒是一种简便高效、省时省力的基因克隆手段，具有传统的克隆方法无法比拟的优点，值得推广应用。本研究将构建的pET15b?CAT 转化BL21(DE3)后经IPTG诱导后表达出N末端带有6个组氨酸标签的CAT,可以方便地通过镍柱进行金属螯和亲和层析，从而得到了纯度较高，具有天然CAT酶活性的融合蛋白His?tag?CAT。

    采用PCR产物靶向克隆法构建了原核表达载体pET15b?CAT,并成功地表达和纯化了融合蛋白His?tag?CAT，为采用外源性CAT防治氧化应激损伤奠定了基础。
 

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