稳定表达EGFR
作者：赵晓蓉，曹利民，彭吉林，王敏，赵晓平，吴砂，李文涵，叶庆， 沈关心
[摘 要] 目的：建立稳定表达EGFRGFP融合蛋白的细胞系。方法：CaCl2法将pEGFREGFP质粒转化DH5α，酶切鉴定后提取质粒经电穿孔转染CHOK1细胞；以EGFP作为荧光报告分子，克隆化培养以获取单克隆阳性细胞；流式细胞术、荧光显微镜术、Western Blot检测转染细胞EGFRGFP融合蛋白的表达；比较稳定转染细胞及未转染细胞的生长曲线；反复冻存、复苏、传代鉴定细胞表达EGFRGFP融合蛋白的稳定性。结果：获得1株稳定表达EGFRGFP融合蛋白的细胞系，命名为CHOEGFRGFP1，融合蛋白主要表达于细胞膜。稳定转染细胞和未转染细胞生长特性无显著差异。结论：成功获得膜表面稳定表达EGFRGFP融合蛋白的细胞系，为研制以EGFR为靶点的抗肿瘤药物以及研究EGFR与其配体间相互作用奠定了基础。[关键词] 表皮生长因子受体；绿色荧光蛋白；细胞系
Establishment of a Cell Line Expressing EGFRGFP Fusion Protein
Abstract: Objective To establish a cell line expressing epidermal growth factor receptor-enhanced green fluorescent protein (EGFRGFP) fusion protein. Methods The E. coli DH5α was transformed with pEGFREGFP plasmid by CaCl2 method. After identified by restriction enzyme digestion, the plasmid was extracted and then transfected into CHOK1 cells by electroporation.A single clone expressing EGFRGFP fusion protein was obtained by seeding the cells into 96-well plates with one cell per well. GFP-positive clones were detected by flow cytometry, inverted fluorescence microscopy, and western blot analysis for EGFRGFP fusion protein expression. The growth rate of the transfected and untransfected CHOK1 cells was compared. The transfected cell was frozen, thawed, and passaged to identify stability of the expression of EGFRGFP fusion protein by FCM. Results One cell line expressing EGFRGFP fusion protein was obtained stably and named after CHOEGFRGFP1, EGFRGFP fusion protein was localized mainly in the cell membrane. There was no significant difference between the transfected and untranfected CHOK1 cells on cell growth rate. Conclusion A cell line expressing the EGFRGFP fusion protein stably was established. This work provides a basis for further development of antitumor durgs targeting EGFR and investigation of interactions between EGFR and its ligands.
Key words: Epidermal growth factor receptor; EGFP; Cell line
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是ErbB受体家族成员之一，属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶。研究发现[1]，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌及前列腺癌等多种恶性肿瘤中有EGFR的过度表达，并认为EGFR的高表达与肿瘤的发生、及预后密切相关。EGFR已成为肿瘤生物的一个新的靶点。本研究建立了稳定表达EGFRGFP融合蛋白的细胞系，以EGFP作为荧光报告分子，为进一步开展以EGFR为靶点的抗肿瘤治疗以及受体配体相互作用的研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞及培养条件：仓鼠卵巢细胞系CHOK1由华中科技大学同济医学院免疫教研室保存，培养于含10％小牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、95％湿度、5% CO2培养箱常规培养。
1.1.2 细菌及质粒：大肠杆菌DH5α菌株由华中科技大学同济医学院免疫学教研室保存，pEGFREGFP质粒由德国哥廷根Max Planck研究院Thomas M Jovin教授惠赠。
1.1.3 主要试剂：限制性内切酶NheⅠ、KpnⅠ（Fermentas MBI公司），PE标记的antiEGFR抗体（BD Pharmigen公司），G418和RPMI 1640培养基（Gibco BRL公司），兔antiEGFR（Santa Cruz 公司），碱性磷酸酶（AP）标记的antirabbit IgG（Sigma公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 pEGFREGFP质粒转化大肠杆菌及鉴定：采用CaCl2法将pEGFREGFP质粒转化DH5α大肠杆菌，挑选卡那霉素抗性菌落碱变性法小量抽提质粒后用限制性内切酶NheⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定，对正确的克隆进行扩增培养，大量抽提高纯度质粒用于转染CHOK1细胞。
1.2.2 pEGFREGFP载体转染CHOK1细胞及筛选：采用电穿孔转染法（Eppendorf电穿孔转染仪）将pEGFREGFP质粒转染CHOK1细胞（电压290 V、时间40 μs）。转染后48 h加入G418工作液，终浓度800 μg/ml，每3～5天换培养液。培养14 d后，将细胞有限稀释并克隆化培养于96孔培养板中。培养5 d后，挑选单克隆细胞生长孔于倒置相差荧光显微镜下观察，发绿色荧光的细胞为阳性细胞，待孔中细胞约铺满半孔时，传代于25 ml培养瓶中扩大培养。
1.2.3 EGFRGFP融和蛋白表达检测:①流式细胞仪（FCM）检测：细胞用胰酶消化，PBS洗一次，按每106个细胞10 μl的比例加入PE标记的antihuman EGFR，室温孵育30 min，PBS洗两次用流式细胞仪（FACS Calibur, BD公司）检测。②倒置相差荧光显微镜观察：细胞培养于96孔板，PBS洗一次，按上述比例加入PE标记的antihuman EGFR，室温孵育30 min，PBS洗5次，倒置相差荧光显微镜（Axiovert 40，Zeiss公司）GFP、PE双通道观察细胞中EGFRGFP融和蛋白的表达，定位并照相。③免疫印迹（Western Blot）：细胞用胰酶消化，PBS洗两次，加入细胞裂解液（150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 72, 5 mM EDTA, 1% triton X100, 0.1% SDS, 1 mM PMSF）0.2 ml，室温抽提蛋白质15 min，10 000 rpm离心15 min，取上清，加入上样缓冲液煮沸3 min，10％SDSPAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜，用含5% milk的0.2％ Tween20/TBS (TBST) 4 ℃封闭过夜，再与antirabbit EGFR 37 ℃孵育2 h，TBST洗涤30 min，加入AP标记的antirabbit IgG 37 ℃孵育1 h，TBST洗涤30 min，加入AP底物显色。④EGFRGFP融合蛋白表达稳定性的检测：将所获单克隆阳性细胞反复液氮罐中冻存、复苏10次，每次传代培养4次以上，流式细胞仪检测其EGFRGFP融合蛋白表达。
1.2.4 细胞生长曲线的绘制：将CHOK1细胞及所获单克隆阳性细胞按1.25×104 /孔接种于24孔细胞培养板，转染细胞中加入G418 400 μg/ml，每24小时每组取3孔细胞记数，均值，连续6 d，绘制细胞生长曲线。
1.3 统计分析利用SAS软件采用配对t检验对数据进行统计学分析。
2 结果
2.1 pEGFREGFP质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳结果
本研究所采用pEGFREGFP质粒为将人EGFR cDNA通过NheⅠ、KpnⅠ双酶切位点插入到pEGFPN3载体上。如图1所示，NheⅠ单酶切可见8.3 kb片断，NheⅠ、KpnⅠ双酶切可见4.7 kb和3.6 kb两片断，与报道一致[2]，表明质粒转化成功。
2.2 稳定表达
EGFREGFP融合蛋白细胞系的建立经克隆化培养，获得1株胞膜呈绿色荧光的单克隆细胞，命名为CHOEGFRGFP1，其细胞形态与CHOK1无明显差别。经流式细胞仪检测，未转染的CHOK1细胞GFP、PE双标记均为阴性，CHOEGFRGFP1细胞GFP、PE双标记阳性率达92%以上，说明EGFRGFP融合蛋白主要表达于细胞膜上（见图2）。倒置相差荧光显微镜观察可见CHOEGFREGFP1主要表现为细胞膜绿色荧光，能与PE标记的antihuman EGFR结合（见图3），与流式细胞仪检测结果一致。Western blot分析CHOEGFRGFP1细胞裂解液可见分子量约166 kDa条带，与文献报道一致[2]。CHOK1细胞裂解液无条带可见（见图4）。CHOEGFREGFP1细胞经反复冻存、复苏，经流式细胞仪检测证明EGFRGFP融合蛋白能稳定表达。
2.3 细胞生长特征比较
CHOEGFRGFP1细胞与未转染CHOK1细胞生长速度无显著性差异（见图5），P>0.05。可见在保证培养条件、接种细胞数、观察时间基本一致的情况下，两者增殖速度接近。
3 讨论
EGFR为单链跨膜分子，分为胞外区、跨膜区、胞内区，胞外区为与配体结合区域，胞内区具有酪氨酸激酶活性，N端位于胞外，C端位于胞内。EGFR参与调节细胞增生与分化，其表达失调与多种恶性肿瘤的发生、转移、疗效有关[1]。研究发现14％～91％的乳腺癌、40％～80％的非小细胞肺癌、30％～50％的前列腺癌及其他多种肿瘤细胞EGFR表达上调[3]。EGFR已成为肿瘤生物的一个新的靶点，其策略包括阻断其与配体结合、采用反义技术阻断其表达、应用特异性抗体抑制其功能及抑制酪氨酸激酶活性等，有些已被批准用于临床[4]。更有意义的是，尽管正常细胞表面也有EGFR的表达，但抗EGFR药物且主要作用于肿瘤细胞，而对正常细胞毒性较小[5]。GFP来源于维多利亚发光水母，当其受到蓝色光激发时会发出绿色荧光，称之为绿色荧光蛋白。GFP目前已被广泛作为一种荧光报道分子。利用基因工程技术，将编码GFP基因整合于感兴趣蛋白cDNA的C端或者N端使其表达融合蛋白，应用荧光显微镜和流式细胞仪可方便地检测到目的基因的表达、筛选出阳性克隆，不需染色，对细胞无毒性，并可实现对该蛋白的细胞内定位[6]事实上，GFP已被改造而产生出具有不同光谱特性的多种荧光蛋白，如EGFP即增强型绿色荧光蛋白、YFP（黄色荧光蛋白）和CFP（蓝绿色荧光蛋白）[7]。GFP及其变种已被广泛用于细胞内分子定位、蛋白间相互作用分析、蛋白质功能、作用机制探索及体内示踪等多方面研究[8]。本研究所采用pEGFREGFP质粒为将人EGFR cDNA通过NheⅠ、KpnⅠ双酶切位点插入到pEGFPN3载体上，通过信号肽引导将EGFR GFP融合蛋白跨膜表达于细胞膜上，且EGFR位于N末端、EGFP位于融合蛋白的C末端，具有野生型EGFR的生物学活性，如与配基EGF结合后可以形成二聚体激活其酪氨酸激酶区域，进一步激活下游信号分子，并可内吞入细胞内[9]。本研究建立了一株细胞膜表面高表达EGFRGFP融合蛋白的细胞系CHOEGFRGFP1，稳定转染细胞和未转染CHOK1细胞形态及生长特征无显著差异，说明表达的融合蛋白对细胞没有明显毒性。此细胞系将进一步用于以EGFR为靶点的抗肿瘤治疗药物研究以及配体、受体间相互作用研究工作中。（文中图3见封二）
[参 考 文 献]
[1] Normanno N, Bianco C, Strizzi L, et al. The ErbB receptors and their ligands in cancer: an overview[J]. Curr Drug Targets, 2005, 6 (3):243-257.
[2] Brock R, Hamelers IH, Jovin TM. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor[J]. Cytometry, 1999, 35(4): 353-362.
[3] Perez-Soler R. HER1/EGFR targeting: refining the strategy[J]. Oncologist, 2004, 9(1): 58-67.
[4] Blackledge G,Averbuch S.Gefitinib ('Iressa', ZD1839) and new epidermal growth factor receptor inhibitors[J]. Br J Cancer, 2004, 90(3): 566-572.
[5] Kari C, Chan TO, Rocha de Quadros M,et al.Targeting the epidermal growth factor receptor in cancer: apoptosis takes center stage[J]. Cancer Res,2003,63(1):1-5.
[6] Wahlfors J, Loimas S, Pasanen T, et al. Green fluorescent protein (GFP) fusion constructs in gene therapy research[J]. Histochem Cell Biol, 2001, 115(1): 59-65.
[7] Daly CJ, McGrath JC. Fluorescent ligands, antibodies, and proteins for the study of receptors[J]. Pharmacol Ther, 2003, 100(2): 101-118.
[8] 潘国栋，黄永章，郭凌郧，等.心肌ａ肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴定[J].郧阳医学院学报，2006，25(2):65-68.
[9] Brock R, Jovin TM. Heterogeneity of signal transduction at the subcellular level: microsphere-based focal EGF receptor activation and stimulation of Shc translocation[J]. J Cell Sci，2001,114(13):2 437-2 447.
