氯胺酮对谷氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞内游离钙浓度的影响

            作者：李清, 朱涛, 秦成名, 刘菊英  
　[摘要]  目的:观察氯胺酮对谷氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞凋亡和胞内游离钙浓度（[Ca2+]i）变化的影响。方法:取新生2~3 d Wistar大鼠T11~L6脊髓背角星形胶质细胞，原代纯化培养。将细胞随机分为：对照组（C组），谷氨酸组（G组），氯胺酮组(K组)，余下3组为谷氨酸+不同浓度氯胺酮组（标记为GK1~GK3组），培养30 min后取各细胞检测[Ca2+]i，再培养48 h检测星形胶质细胞凋亡率。结果:与C组比较，G组细胞发生了大量凋亡（P＜0.01），[Ca2+]i显著升高（P＜0.01）；与G组比较，GK2组细胞凋亡率和[Ca2+]i明显降低（P＜0.05），GK3组细胞凋亡率和[Ca2+]i显著降低（P＜0.01）。结论:适量氯胺酮通过抑制细胞内钙超载显著抑制了谷氨酸诱导星形胶质细胞凋亡。

　　[关键词]  氯胺酮；谷氨酸；脊髓背角；星形胶质细胞；凋亡；[Ca2+]i

　　Abstract： Objective To observe the effect of ketamine on Glutamate-induced apoptosis and the intracellular dissociated Ca2+ concentration ([Ca2+]i) in rat cultured spinal cord dorsal horn astrocytes. Methods  Cells were derived from T11-L6 spinal cord dorsal horn of 2-3 days old Wistar rat and purified for two weeks, they were treated with following six conditions: (1)sham wash with Hanks solution (control group-C); (2)100 μmol/L of Glutamate (group-G); (3)100 μmol/L ketamine (group-K); (4-6) 100 μmol/L of Glutamate was added and 30 mins later, ketamine at 10, 50 or 100 μmol/L was superimposed, respectively (group GK1-GK3). After 30 mins or 48 hrs treatment, the [Ca2+]i and the apoptotic cell death was analyzed with flow cytometer. Results Apoptotic cell death and the [Ca2+]i was significantly increased in Group G when compared with Group C (P<0.01). The apoptotic astrocytes and the [Ca2+]i was significant low in GK2 group (P<0.05) and GK3 group (P<0.01) than in Group G. There was no effect of ketamine itself at 100 μmol/L on apoptotic cell death and [Ca2+]i. Conclusion Ketamine at 100 μmol/L can inhibit glutamate-induced apoptosis cell death in rat cultured spinal cord dorsal horn astrocytes. Its anti-apoptotic mechanisms may be explained by inhibiting the intracellular Ca2+ overloading.

　　Key words: Ketamine; Glutamate; Spinal cord dorsal horn; Astrocyte; Apoptosis; [Ca2+]i

　　脊髓背角的谷氨酸是初级感觉传入的主要兴奋性神经递质。外周持续性伤害刺激可使初级感觉传入神经末稍释放大量谷氨酸，激活背角星形胶质细胞，通过神经元和星形胶质细胞之间的电――化学信号转导参与伤害性信号调控，导致兴奋性毒性作用，诱发星形胶质细胞损伤或凋亡[1-2]。目前对该过程中谷氨酸诱导星形胶质细胞凋亡的机制不完全清楚。氯氨酮是一种非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，它能通过血脑屏障与NMDA受体离子通道结合，阻断钙离子通道。有研究表明，氯胺酮可抑制脊髓星形胶质细胞的激活[3]。有关氯胺酮对谷氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞凋亡的影响尚无报道。本实验通过对大鼠脊髓背角星形胶质细胞原代纯化培养，用氯胺酮对此进行探讨。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物、主要仪器和试剂出生1～3 d Wistar大鼠20只，雌雄各半，体重10～15 g(武汉大学实验动物中心)；CB150细胞培养箱(Binder公司，德国)； EPICS XL流式细胞仪(Beckman culture公司，美国)； DMEM/F12、胎牛血清和小牛血清（HyClone公司，美国）；DNA流式检测试剂盒和Fluo-3-AM(Coulter公司，美国)。

　　1.2  星形胶质细胞原代培养出生2～3 d Wistar大鼠麻醉后，解剖显微镜下取T11～L6脊髓背角组织，加入0.25%胰蛋白酶置37 ℃、5%CO2细胞培养箱中消化30 min，将细胞悬液接种于培养瓶内（细胞培养基为含10%胎牛血清和5%小牛血清和0.3%葡萄糖的DMEM/F12），培养7～9 d后置于180转/min恒温摇床上摇15 h，将其传代接种在24 孔培养板中，细胞接种密度为5×106/ml，3～7 d后通过细胞鉴定即可用于实验。免疫细胞化学法鉴定培养的细胞，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞为星形胶质细胞。

　　1.3  实验分组将培养细胞随机分为6组，每组8 孔细胞：对照组（C组）加入Hanks液50 μL，谷氨酸组（G组）加入谷氨酸至终浓度100 μmol/L；氯胺酮组(K组)加入氯胺酮至终浓度100 μmol/L；GK1、GK2、GK3组先加入谷氨酸至终浓度100 μmol/L，30 min后分别加入氯胺酮至终浓度10、50、100 μmol/L。谷氨酸和氯胺酮均用Hanks液进行稀释，加入药物后各孔培养基体积均为1.55 ml。细胞培养30 min或48 h后用于实验。

　　1.4  流式细胞仪检测星形胶质细胞内游离钙浓度加药后各组细胞培养30 min，去培养基，用PBS洗2次，0.125%胰蛋白酶消化5 min；待细胞收缩变圆后，用无钙缓冲液PBS终止消化并制成细胞悬液；低速离心（500 rpm，5 min），弃去上清液，再用PBS冲洗2次； 收集各组细胞重悬于PBS中，调整细胞密度为5×105个/ml；取上述细胞悬液1 ml加入Fluo3-AM至终浓度为10 μmol/L，置CO2培养箱孵育1 h(37 ℃，避光)，其间轻轻振荡几次；取出细胞悬液离心，再用无钙PBS反复洗涤3次，去除多余染料；再用PBS重悬至1 ml，于流式细胞仪检测，激发波长为506 nm，发射波长为526 nm；随机测定单个星形胶质细胞的荧光强度值，取1万个细胞的荧光强度值的平均值为各组测定值。

　　1.5  流式细胞仪检测凋亡细胞数加药后各组细胞培养48 h后，弃培养基，PBS冲洗2次，0.125%胰蛋白酶消化，收集1×106个细胞，1 ml PBS重悬，300目尼龙网过滤后离心（1 000 rpm，5 min），弃上清，应用DNA流式检测试剂盒检测凋亡细胞数。

　　1.6  统计学处理用SPSS10.0软件进行统计处理，计量资料用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡和胞内游离钙浓度相对荧光值变化　K组与C组凋亡细胞和[Ca2+]i比较差异无统计学意义(P＞0.05)。与C组比较，G组和GK1组星形胶质细胞凋亡增加，[Ca2+]i升高(P＜0.01)，两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与G组比较，GK2组凋亡细胞明显减少，[Ca2+]i也明显降低(P＜0.05)，GK3组凋亡细胞显著减少，[Ca2+]i显著降低(P＜0.01)。见表1。细胞凋亡峰如图1。

　　表1各组流式细胞仪检测细胞凋亡值和胞内游离钙浓度相对荧光值（略）

　　与C组比较**P＜0.01；与G组比较#P＜0.05，##P＜0.01

　　3  讨论

　　Fluo-3-AM为高度特异性新型Ca2+荧光指示剂，可灵敏地反映细胞内游离钙离子浓度变化，Fluo-3-AM进入细胞后经非特异性酯酶脱去AM酯，成为脂溶性Fluo-3留在细胞内。当Fluo-3与细胞游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，敏感性高，当用506 nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。本实验用谷氨酸非选择性作用于离体纯化培养的脊髓背角星形胶质细胞谷氨酸受体，结果显示星形胶质细胞内游离钙浓度升高，并发生大量凋亡，氯胺酮能明显降低谷氨酸引起的背角星形胶质细胞内游离钙浓度，显著抑制了细胞凋亡，且随氯胺酮的浓度升高其抑制效应加强。表明谷氨酸激活星形胶质细胞，使其胞内钙超载诱发凋亡，适量氯胺酮通过抑制胞内钙超载从而抑制了星形胶质细胞凋亡。脊髓的各种谷氨酸受体亚型主要分布于背角的Ⅰ～Ⅲ层，谷氨酸与初级感觉传入有密切关系[4]，NMDA受体是谷氨酸离子型受体的一个亚型。细胞内游离Ca2+作为“第二信使”参与细胞功能调节，在神经细胞内和突触传递的信号转导中发挥着极其重要的作用。研究表明，在长期神经病理痛病程中，兴奋性氨基酸特别是谷氨酸过度释放[5]，激活NMDA受体，导致受体门控离子通道开放，使Ca2+、Na+、Cl-、H2O大量进入胞内，胞内Ca2+池释放增加，K+大量外流，引起胞内Ca2+超载[6]，诱发神经细胞肿胀坏死或大量凋亡，并触发或/和增强细胞内的许多Ca2+依赖性过程：激活蛋白激酶、磷脂酶和一氧化氮合酶（NOS）等，兴奋多价不饱和脂肪酸，导致花生四烯酸（AA）代谢大大增强，钙泵活性降低，ATP能量产生不足等；促进突触前膜EAAa大量释放，激活突触后NMDAR操纵的Ca2+通道，使细胞内Ca2+浓度进一步持续升高，加重Ca2+内环境稳态失衡，导致神经细胞损伤[7]。氯胺酮可抑制因NMDAR激活而诱导的星形胶质细胞凋亡[8]。本实验中谷氨酸激活星形胶质细胞，使其胞内钙超载从而诱发细胞大量凋亡，推测谷氨酸使星形胶质细胞的NMDA受体过度兴奋，诱发细胞内Ca2+超载，从而产生上述一系列生化级联反应导致细胞损伤或凋亡。研究发现，NMDA受体阻断剂（MK801、Ketamine等）可通过抑制受体活性，减弱兴奋性突触后电流，抑制谷氨酸受体介导的兴奋性突触传递，减少Ca2+内流，降低胞内钙超载，从而降低NOS活性，NO生成减少，达到镇痛和神经保护作用。Lohr等[9]研究发现氯胺酮作用于神经元和胶质细胞NMDA受体，可阻断其激活后介导的Ca2+内流，避免细胞内Ca2+超载，从而抑制细胞凋亡的发生。本实验氯胺酮通过作用于星形胶质细胞NMDA受体，阻断Ca2+内流导致的Ca2+超载而抑制细胞凋亡，同时还可能抑制星形胶质细胞对谷氨酸的大量摄取，降低其能量代谢，抑制了其因能量代谢衰竭而诱发的凋亡，发挥神经保护作用。其抑制机制还有待深入研究。

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　　[1]     Julie WF,Steven FM,Linda RW.Glial activation and pathological pain[J].Neurochemistry Inte,2004,45:389-395.    
　　[2]     Kazuhiro T,Akemichi B,Toshio M.Astrocyte apoptosis:implications for neuroprotection[J].Prog Neurobioliogy,2004,72:111-127.    

　　[3]     项红兵，田玉科，孙  怡.氯胺酮对吗啡耐受小鼠脊髓星形胶质细胞的影响[J].中华麻醉学杂志，2004，24(4):290-293.    

　　[4]     曹东元, 赵  晏.谷氨酸在初级感觉传入中的作用[J].生理进展,2003,34:361-364.    

　　[5]     Sung B,Lim G,Mao J.Altered expression and uptake activity of spinal glutamate transporters after nerve injury contribute to the pathogenesis of neuropathic pain in rats[J].J Neurosci,2003,23(7):2 899-2 910.    

　　[6]     胡  波,孙圣刚,何立铭,等.谷氨酸诱发培养的大鼠星形胶质细胞内钙升高的机制[J].神经科学杂志，2004,20(1):24-28.    
　　
　　[7]     韩济生主编.神经科学原理.第二版.北京：北京医科大学出版社，1999:527-528，1 077-1 079.    

　　[8]     刘菊英，李  清，熊顺华,等.氯胺酮对NMDA诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞凋亡的影响[J].郧阳医学院学报，2005，24(6):332-334.    

　　[9]     Lohr C,Deitmer JW.Intracellular Ca2+ release mediated by metabotropic glutamate receptor activation in the leech glial cell[J].J Exp Biol,1997,200:2 565-2 573.