反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷对大鼠肝微粒体蛋白质及细胞色素P450的影响

【摘要】  目的：研究反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷对大鼠肝质量、肝微粒体蛋白质及细胞色素P450的影响。方法:大鼠分为空白对照组、反式白藜芦醇组及反式白藜芦醇苷组，分别连续给予等摩尔量的反式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷(116.69、200mg/(kg·d，连续灌胃给药7d后，分光光度法测定大鼠肝质量、肝微粒体蛋白质浓度及细胞色素P450质量分数，氨基比林_N_脱甲基酶、红霉素脱甲基酶和7_乙氧基_3_异吩哐恶唑酮脱烃酶的活性。结果：反式白藜芦醇组及反式白藜芦醇苷组大鼠肝质量、肝微粒体蛋白浓度与空白对照组比无统计学意义；而2个剂量组大鼠肝微粒体中细胞色素P450、氨基比林_N_脱甲基酶、红霉素_N_脱甲基酶和7_乙氧基_3_异吩哐恶唑酮脱烃酶的活性与空白对照组比有统计学意义(P<0.05，对细胞色素P450酶有抑制作用，但剂量组间无统计学意义。结论：反式白藜芦醇与反式白藜芦醇苷可引起肝药酶对某些药物代谢的改变。

【关键词】  反式白藜芦醇；反式白藜芦醇苷；肝质量；肝微粒体蛋白质；细胞色素P450

    ［Abstract］Objective：To study the effects of trans_resveratrol and trans_piceid on liver weight, contents of microsomal protein and cytochrome P450. Methods: Rats were divided into trans_resveratrol, trans_piceid and control groups. The UV method was used to detect the liver weight, contents of microsomal protein and cytochrome P450, the activities of aminopyrine_N_demethylase, erythromycin_N_demethylase and coumarin 7_hydroxylation of rats, after administration with equimolar trans_resveratrol(116.69 mg/(kg·dand trans_piceid(200 mg/(kg·dfor 7 days. Results: The study showed no significant differences on liver weight and contents of microsomal protein among three groups. Compared with control group, the activities of cytochrome P450,aminopyrine_N_demethylase, erythromycin_N_demethylase and coumarin 7_hydroxylation between two dosage groups(P<0.05had statistical significance. But there was no significant difference between two dosage groups.  Conclusion: Trans_resveratrol and trans_piceid can result in alteration of metabolism of some drugs affected by drug metabolizing enzyme of liver.

    ［Key Words］trans_resveratrol，trans_piceid，liver weight，microsomal protein，cytochrome P450体内、外实验表明，白藜芦醇及白藜芦醇苷具有广泛的生物学活性，因而近年来对它们相应的稳定单体反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷的药理作用研究不断深入，主要涉及抗氧化、抗炎、抗癌、心血管保护及神经保护等多方面［1_2］，但对其在生物体内药代动力学过程还知之甚少。肝药酶分Ⅰ相和Ⅱ相药物代谢酶，细胞色素P450(CYP是Ⅰ相中催化多种药物、前毒物、前致癌物等外源性物质的主要酶类，主要有CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A等，本文考察大鼠连续应用反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷后，对其肝质量、肝微粒体蛋白质及细胞色素P450的影响，及对CYP3A、CYP1A、CYP2E1活性的影响。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    仪器：UV8500紫外_可见光分光光度计(天美公司，，RF_5000荧光分光光度计(岛津公司，日本，3K30高速冷冻离心机(Sigma公司，美国，DY89_Ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝公司，中国，QL_901漩涡混合器(江苏海林仪器厂，中国。

    试剂：反式白藜芦醇(西安冠宇生物技术有限公司，中国。分析纯级，反式白藜芦醇苷(深圳海王药业股份有限公司，中国。分析纯级，羧甲基纤维素钠(天津市大茂化学试剂厂，中国。分析纯级，氨基比林(北京化学试剂公司，中国。化学纯，红霉素(北京鼎国生物技术有限责任公司，中国。化学纯，7_羟基_3_异吩哐恶唑酮、7_乙氧基_3_异吩哐恶唑酮(Sigma公司，美国。分析纯级。NADPH(北京鼎国生物技术有限责任公司，中国。分析纯级；Tris(华美生物工程公司，中国。分析纯级、Hepes(Promega公司，美国。分析纯级；其他试剂均为分析纯级；CO气体由广州气体厂提供。

    动物：健康雄性SD大鼠(南方医科大学实验动物中心提供24只。常规条件饲养，动物房定时通风消毒，自由饮食饮水。

    1.2  方法

    大鼠随机分为空白对照组(8只、反式白藜芦醇组(8只及反式白藜芦醇苷(8只。反式白藜芦醇组(116.69mg/(kg·d和反式白藜芦醇苷组(200mg/(kg·d连续灌胃给药7d，末次给药后次日处死。空白对照组予等容量的溶媒，其余操作同上。

    1.2.1  肝质量测定及肝微粒体制备  大鼠称重处死后尽量放血，迅速取出肝脏，充分去除血液后测定肝指数(每100g体质量的肝质量。并用组织匀浆机在冰浴中制成匀浆。肝匀浆10000g，4℃离心20min，取上清液移至离心管中，105000g，4℃离心60min。弃上清液，淡红色沉淀物即为肝微粒体。将肝微粒体沉淀取出后用体积分数1.15％ KCL的磷酸缓冲液悬浮混匀后，分装于冻存管中，干冰速冻后，置_70℃液氮保存。

    1.2.2  大鼠肝微粒体蛋白质量分数测定  采用考马斯亮蓝染色法，将待测大鼠肝微粒体样本稀释50倍后，于595nm处，以空白管调零，测吸光度，蛋白的质量分数。

    1.2.3  细胞色素P450的质量分数测定  根据考马斯亮蓝染色法测定大鼠肝微粒体蛋白的质量分数，采用CO还原差示光谱法，将待测样品稀释为质量浓度5mg/mL的微粒体混悬液。吸取0.05mol/L的Tris缓冲液5.5mL，加入待测微粒体混悬液0.5mL，然后加入质量分数10％的连二亚硫酸钠0.04mL，立即混匀。等量分装到2个比色杯中，分别放入紫外分光光度计的对照品和样品池中。将样品池中比色杯取出，充CO大约1min，从450～490nm扫描，并记录OD值。

    1.2.4  氨基比林_N_脱甲基酶活性测定  在各试管中分别加甲醛溶液(0.5mmol/L0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL,并分别用蒸馏水补充到1mL(此时各试管甲醛终浓度为：0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L。37℃水浴3min，加入体积分数12.5％的三氯乙酸1.5mL中止反应，2700g，离心10min后，取上清液，加入Nash试剂1mL，60℃水浴10min，自来水冷却，412nm波长处上机检测，绘制甲醛标准曲线。吸取待测微粒体0.5mL，加入Hepes缓冲液0.4mL，然后加入质量浓度20mg/mL氨基比林0.1mL，37℃水浴3min，加入100mmol/L NADPH 0.01mL启动反应，37℃水浴30min。以后操作步骤同甲醛标准曲线制备。以系列浓度的甲醛为横坐标，OD值为纵坐标，求得甲醛线性回归方程，并以此计算酶活性。

    1.2.5  红霉素脱甲基酶活性测定  除去底物应用4mmol/L的红霉素外，其余测定步骤同氨基比林_N_脱甲基酶活性测定。

    1.2.6  7_乙氧基_3_异吩哐恶唑酮脱烃酶活性测定  以体积分数20％的二甲基亚砜配置10μmol/L的7_羟基_3_异吩哐恶唑酮标准工作液，在各试管中分别加入标准工作液(10μmol/L0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mL，用0.1mol/L pH 7.6的Tris_HCl补充到2mL(此时各试管7_羟基_3_异吩哐恶唑酮终浓度为0、1、2、4、6、8μmol/L。37℃水浴2min，室温放置1min，将荧光分光光度计激发光和发射光调至Ex=535nm,Em=586nm。上机检测。绘制7_羟基_3_异吩哐恶唑酮标准曲线。`

    吸取稀释后的待测微粒体悬液0.1mL，加入1mmol/L的7_乙氧基_3_异吩哐恶唑酮0.01mL，再加入0.1mol/L的Tris_HCl液(pH 7.61.9mL，37℃水浴2min，加入50mmol/L NADPH 0.01mL，室温放置1min，上机检测。以系列浓度的7_羟基_3_异吩哐恶唑酮为横坐标，OD值为纵坐标，求得7_羟基_3_异吩哐恶唑酮线性回归方程，并以此酶活性。

    1.2.7  统计学处理  采用SPSS13.0软件，所得数据用单因素方差分析及LSD法进行多重比较。甲醛标准曲线、7_羟基_3_异吩哐恶唑酮标准曲线测定通过线性回归分析判断方程是否具有统计学意义。

    2  结果

    2.1  标准曲线

    甲醛在0.05～0.5mmol/L范围内与OD值有良好的线性关系，最低检测限0.05mmol/L。以OD值为纵坐标，甲醛系列浓度为横坐标绘制标准曲线图，线性方程为y=2.2768x+0.0015,r=0.9977。方程经假设检验，F=1702.967，P=0.000，方程有统计学意义。

    以系列浓度7_羟基_3_异吩哐恶唑酮为横坐标，OD值为纵坐标，进行线性回归。标准曲线方程为y=1.9962x+1.4741，r=0.9997。检测范围10～200mmol/L，最低检测限10mmol/L。方程经假设检验，F=20095.757，P=0.01，方程有统计学意义。

    2.2  反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷对大鼠肝质量、肝微粒体蛋白质量分数的影响

    反式白藜芦醇(116.69mg/(kg·d及反式白藜芦醇苷(200mg/(kg·d连续灌鼠胃7d后，大鼠肝质量、肝微粒体蛋白质量分数与空白对照组比无统计学意义(表1。表1  大鼠肝指数及肝微粒体蛋白质量分数(测定结果

    Table 1  Effects of trans_resveratrol and trans_piceid on liver index and protein content in rats

    组别n/只m(肝质量/g肝指数?m(蛋白质/肝质量/(mg/g空白对照组87.96±0.262.60±0.050.87±0.20反式白藜芦醇组87.93±0.4312.64±0.0810.82±0.171反式白藜芦醇苷组87.99±0.3812.67±0.1310.77±0.081

    与空白对照组比  1P>0.05  ?每100g体质量的肝质量/g

    2.3  大鼠肝微粒体细胞色素P450酶测定结果

    三组大鼠肝微粒体细胞色素P450酶系的测定结果见表2。白藜芦醇组和白藜芦醇苷组对大鼠肝微粒体中细胞色素P450、氨基比林_N_脱甲基酶、红霉素脱甲基酶和7_乙氧基_3_异吩哐恶唑酮脱烃酶的活性与空白对照组比有统计学意义(P<0.05，2个剂量组对细胞色素P450酶有抑制作用，但剂量组间无统计学意义。表2  反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷对大鼠肝药酶(的影响与空白对照组比  1P<0.05

    3  讨论

    细胞色素P450在外源性化合物的生物转化中起着十分重要的作用，它的活性决定药物的代谢速率，与药物的清除率有着直接关系。研究发现，中药有效成分也可作用于药物代谢酶系统，影响其他药物的代谢，其中以黄酮、黄酮衍生物和呋喃香豆素类化合物的研究较系统完善，而作为多种中草药中有效活性成分的类黄酮类化合物反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷对肝微粒体蛋白质及细胞色素P450的影响在国内尚未见报道［5］。

    红霉素脱甲基酶活性的测定主要反映CYP3A的活性，而7_乙氧基_3_异吩哐恶唑酮是CYP4501A的相对特异性底物，其脱烃反应生成的异吩哐恶唑酮多少可反映药物对CYP1A的诱导或抑制作用，氨基比林_N_脱甲基酶活性的测定可反映CYP2E1的活性［4］。本实验的意义主要是通过探讨反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷在大鼠体内代谢过程中对肝脏P450酶活性的影响，并比较两者对肝药酶作用强度的差异，进一步为该药在人体中代谢的预测提供依据，预测临床上该药可能发生的相互作用，指导临床的合理联合用药。试验结果提示反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷对细胞色素P450酶及CYP1A、CYP2E1、CYP3A均有显著性抑制作用，因此在临床上与上述代谢酶的底物合用时，应注意避免药物相互作用的发生，减少药物不良反应。

    近年来，白藜芦醇及白藜芦醇苷抗肿瘤的效能日益受到关注，研究结果显示白藜芦醇及白藜芦醇苷在肿瘤启动、促进及的3个阶段均有抑制作用，其作用因细胞类型不同而异，机制较为复杂。CYP1A主要参与代谢激活多环芳烃及芳香胺类化学致癌物，CYP2E通过去烷基及硝基等反应使亚硝胺类致癌物活化，CYP3A则参与黄曲霉素B1的活化，而反式白藜芦醇及白藜芦醇苷对上述3种CYP450酶的抑制作用为其在癌症防治方面的应用提供了新思路［6］。

【】
  ［1］PROKOP J, ABRMAN P, SELIGSON A L, et al. Resveratrol and its glycon piceid are stable polyphenols［J］. Med Food, 2006, 9(1: 11-14.

［2］VITAGLIONE P, MORISCO F, CAPORASO N, et al. Dietary antioxidant compounds and liver health［J］. Crit Rev Food Sci Nutr, 2004, 44(8: 575-586.

［3］徐叔云, 卞如镰, 陈修. 药理实验方法学［M］. 3版. 北京： 人民卫生出版社, 2002: 708-710.

［4］周宏灏. 遗传药［M］. 北京: 出版社, 2001: 76-98.

［5］PIVER B, BERTHOU F, DREANO Y, et al. Differential inhibition of human cytochrome P450 enzymes by epsilon_viniferin, the dimer of resveratrol: comparison with resveratrol and polyphenols from alcoholized beverages［J］. Life Sci, 2003, 3(9: 1199-1213.

［6］PIVER B, FER M, VITRAC X, et al. Involvement of cytochrome P450 1A2 in the biotransformation of trans_resveratrol in human liver microsomes［J］. Biochem Pharmacol, 2004, 68(4: 773-782.