宫颈癌细胞中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶及其选择性剪接亚型真核表达载体的构建和表达

【摘要】  目的：构建宫颈癌细胞中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)及选择性剪接亚型NRDRB1真核表达载体，并转染HeLa细胞表达融合蛋白和native蛋白。方法：分别以pDONR_NRDR、pDONR_NRDRB1载体为模板，用PCR方法扩增两端带有酶切位点的NRDR及NRDRB1编码区序列，酶切后连接到pCDNA3、pCMV_Myc真核表达载体上，经酶切、测序鉴定后，转染HeLa细胞16?h，Western blot检测蛋白表达情况，蛋白质谱分析鉴定表达蛋白。结果：成功构建NRDR、NRDRB1真核表达载体，转染HeLa细胞后，可表达带有Myc标签的蛋白和不带标签的native蛋白；质谱分析结果进一步证实所表达的蛋白为NRDR和NRDRB1。结论：获得了在真核细胞中表达的NRDR、NRDRB1蛋白，为进一步研究其功能提供了实验材料。

【关键词】  辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶 选择性剪接 宫颈癌 真核表达

    ［Abstract］Objective： To construct the expression plasmids of NADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase(NRDR)and NRDRB1， and to express the proteins in mammalian cells. Methods： The coding regions of NRDR and NRDRB1 were amplified from pDONR vectors. The fragments of NRDR and NRDRB1 were ligated with mammalian expression vector pCDNA3 and pCMV_Myc after restriction enzyme. HeLa cells were transfected with the recombinant expression plasmids， and the target proteins were detected by Western blot. Results： The recombinant plasmids of pCDNA3_NRDR， pCDNA3_NRDRB1， pCMV_Myc_NRDR and pCMV_Myc_NRDRB1 were obtained and identified by restriction enzyme and sequencing. After transfection 16 hours， the target proteins were detected by Western blot. The expressed proteins were identified by the mass spectrometry. Conclusion： The recombinant NRDR and NRDRB1 from human cervical carcinoma cells can be expressed in mammlian cells.

    ［Key Words］NADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase；alternative splicing；cervical carcinoma；recombinant expression

    辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)具有较强的视黄醇氧化和视黄醛还原活性，存在于哺乳动物多种组织中，是参与全反式视黄酸或称维甲酸(atRA)代谢通用途径的关键酶。参与atRA代谢的酶可通过影响atRA与其前体或类似物在细胞内的转化而影响其生物学效应，因而与肿瘤发生等生物学过程密切相关。研究表明，视黄醇及其它视黄酸类物质对于维持正常宫颈上皮功能、抑制宫颈癌组织的生长具有重要作用［1～3］，视黄醇缺乏或视黄酸物质代谢紊乱是除人乳头瘤病毒感染外引发宫颈癌的另一重要病因［4， 5］，我们从人宫颈癌细胞中克隆鉴定了一种视黄醇脱氢/还原酶_辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NADP_dependent retinol dehydrogenase/reductase，NRDR)，同时发现了一种新的NRDR选择性剪接亚型NRDRB1［6］(Genbank accession number DQ325464)。为深入研究宫颈癌细胞中NRDR、NRDRB1的活性和功能，本研究构建了哺乳动物细胞表达载体，对上述两种蛋白进行表达。

    1材料与方法

    1?1细胞株及主要试剂

    HeLa细胞(上海细胞所，)常规培养于含体积分数10%的胎牛血清(Gibco公司，美国)的RPMI 1640培养基中。含NRDR、NRDRB1编码区的pDONR载体由本室构建并保存。高保真Taq酶pfu，pCDNA3和pCMV_Myc载体(Invitrogen公司，美国)，限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、BglⅡ、SalⅠ、NotⅠ以及T4DNA连接酶(NEB公司，德国)，Western blot分析试剂(Pierce公司，美国)，nitrocellulose膜(Amersham公司，美国)，高纯度质粒大提试剂盒、SuperFect转染试剂盒(Qiagen公司，德国)。

    1?2引物设计与合成

    根据NRDR基因序列并针对pCDNA3载体设计引物序列，上游引物：5′_TCGAGATCTATGGCCAG_CTCCGGGATG_3′，下游引物：5′_AAGGTCGACTCAGAGGCGGGACGGGGTT _3′；针对pCMV_Myc载体设计的引物序列，上游引物：5′_GATAGATCTGGATGGCCAGCTCCGGGATG_3′，下游引物：5′_AAGGCGGCCGCTCAGAGGCGGGACGGGGTT_3′，引物由广州Invitrogen公司合成。AGATCT、GTCGAC、GCGGCCGC分别为BglⅡ、SalⅠ和NotⅠ的酶切位点，5′端的3个碱基为保护序列。

    1?3真核表达载体的构建及转染

    分别以pDONR_NRDR、pDONR_NRDRB1为模板，以上述带有酶切位点的引物进行PCR扩增。PCR产物分别经BglⅡ、SalⅠ和BglⅡ、NotⅠ酶切，胶回收纯化酶切片断。pCDNA3、pCMV_Myc载体分别用BamHⅠ、XhoⅠ和BglⅡ、NotⅠ进行酶切，纯化载体酶切产物与NRDR、NRDRB1酶切片断连接，转化感受态菌(DH5α)。挑取单菌落进行PCR鉴定，并提取质粒测序。对于测序鉴定的单菌落细菌进行扩大培养，用高纯度质粒大提试剂盒提取质粒，SuperFect转染试剂盒转染对数生长期的HeLa细胞。

    1?4重组蛋白检测

    收集转染16?h的HeLa细胞，提取细胞总蛋白，经质量分数12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS_PAGE)，将蛋白转移至nitrocellulose膜，质量分数1%的BSA室温封闭1?h。一抗(已纯化的NRDR抗兔多克隆抗体，本室制备)孵育1?h，1×PBS洗3次，每次5?min；二抗采用horseradish peroxidase标记的goat anti_rabbit IgG(1∶3000，Pierce公司，美国)孵育1?h，用Pierce ECL kit进行化学发光，检测NRDR、NRDRB1蛋白表达。

    1?5质谱分析

    将目的蛋白从SDS_PAGE胶上切下，经胰蛋白酶消化处理后，在质谱仪上对目的蛋白进行肽指纹图谱分析。

    第2期宋旭红等.宫颈癌细胞中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶及其选择性剪接亚型真核表达载体的构建和表达2结果

    2?1NRDR、NRDRB1克隆至真核表达载体

    将扩增的NRDR、NRDRB1片断与真核表达载体酶切，连接后转化DH5α，挑取单菌落用PCR方法鉴定(图1)，提取质粒后进行酶切鉴定(图2)，测序结果证实NRDR、NRDRB1已克隆到pCDNA3、pCMV_Myc真核表达载体，读码框正确，且无任何碱基突变。图1NRDR及NRDRB1菌落PCR分析结果

    Fig?1Verification of NRDR and NRDRB1 by colony PCR

    L1～4NRDRMDNA markerL5～8NRDRB1图2重组质粒酶切鉴定

    Fig?2Identification of recombinant plasmid by restriction digestion

    MDNA markerL1，2NRDRL3，4NRDRB1

    2?2Western blot检测蛋白表达

    利用本室制备的NRDR抗兔多克隆抗体检测蛋白表达。多克隆抗体可特异检测到NRDR及NRDRB1蛋白表达(图3)。NRDR多抗也可检测到带Myc标签的NRDR和NRDRB1蛋白表达，并与抗Myc单抗检测结果一致，说明目的蛋白在HeLa细胞中获得表达。图3Western blot检测蛋白表达

    Fig?3Detection of protein expression by Western blot

    L1，2NRDRL3NRDRB1L4未转染的HeLa细胞对照

    2?3质谱分析结果

    将表达的目的蛋白从SDS_PAGE胶上切下，经胰蛋白酶处理后进行肽指纹图谱分析，将所得的分子质量在蛋白数据库中检索，证实为NRDR和NRDRB1蛋白(图4)。

    图4肽指纹图谱(上?NRDR下?NRDRB1)

    Fig?4Results of mass spectrometry

    3讨论

    atRA是动物体内“激素样”的生理活性物质，对胚胎发育、细胞增殖、细胞分化等生理过程具有重要的调控作用。NRDR是首先从兔肝中发现并纯化的一种新的atRA代谢酶，具有很高的视黄醇氧化、视黄醛(retina1)还原活性［7］。NRDR在生理条件下表现出比已知的短链脱氢酶(SDR)家族其他成员更强的retinal还原活性，故在维持内环境RA及retinal的稳定状态中发挥重要作用［7］。研究显示，atRA在调节正常组织、癌前病变及肿瘤组织的生长、分化和凋亡方面发挥重要作用。许多肿瘤，尤其是上皮来源的肿瘤组织中，存在atRA代谢的异常，而这种异常可能与肿瘤的发生密切相关［8， 9］。我们在宫颈癌细胞中发现并克隆了一种新的NRDR选择性剪接亚型NRDRB1，其在宫颈鳞癌组织中显著过表达，可能与宫颈癌的发生密切相关。

    我们采用Invitrogen公司的Gateway Technology基因克隆和蛋白表达系统，已经在E.coli中获得了高效表达的重组NRDR及NRDRB1，但带有6×His标签的蛋白多以包涵体的形式存在，难以获得有活性的蛋白，而兔肝NRDR在E.coli中可获得可溶的、有活性的表达。因此有必要采用真核细胞表达系统对人NRDR、NRDRB1进行重组表达，用于酶活性检测分析。本研究构建了NRDR、NRDRB1真核表达载体，并在哺乳动物细胞中进行表达，为进一步研究其功能提供了实验材料。高效液相色谱检测分析表明，我们在真核细胞中表达的NRDR蛋白具有视黄醛还原活性，但明显低于兔肝NRDR［10］。考虑可能是因为除NRDR外人体内有多种酶参与atRA代谢，或者NRDR还有其它的生理性底物，目前本课题组正在对NRDR可能的生理性底物进行检测分析，以期更深入了解NRDR的生理功能。

【】
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