羟基肉桂酸衍生物清除羟自由基活性的构效关系

【摘要】  目的:研究4_羟基肉桂酸(4_HCA)衍生物清除羟自由基(·OH)活性并初步分析其构效关系。方法:用邻菲罗啉化学发光法测定4_HCA衍生物清除·OH活性。结果:化学结构不同的4_HCA衍生物体外清除·OH的能力有较大差异。结论:4_HCA苯环上3、5位取代基的引入可以明显地影响此类化合物抗·OH活性，甲氧基和乙氧基可明显提高活性，溴次之，硝基则降低活性。

【关键词】  4_羟基肉桂酸 羟自由基 构效关系

    Method: The scavenging activity on hydroxyl radical was detected by ophenathroline chemiluminescent system. Results: The scavenging activity on hydroxyl radical of 4_HCA was variant. Conclusion: 3 and 5 substituted group on the benzene ring of 4_HCA can obviously influence the scavenging activity on hydroxyl radical, the activity can be increased by methoxyl , ethoxyl or bromine, whereas decreased by nitryl.

    ［Key Words］4_hydroxy cinnamic acid; hydroxyl radical; structure_activity relationship

　　羟自由基(·OH)是活性氧自由基中最活泼、毒性最强的一种，可直接导致DNA等生物大分子的破坏而引发一系列疾病［1，2］。细胞在有氧代谢过程中，可通过多种途径产生·OH，机体清除·OH的活性物质不足将导致·OH堆积而引发疾病，所以，研究·OH清除剂具有很强的现实意义。4_羟基肉桂酸(4_HCA)衍生物具有较为明确而相对强大的清除·OH［3，4］能力，对一些自由基导致的病变和损伤具有良好的预防和保护作用。本文对4_HCA进行了结构改造，合成了10个4_HCA［5］，并用邻菲罗啉化学发光法［6］测定其清除由CuSO4_phen_Vc_H2O2系统产生的·OH的能力，研究4_HCA衍生物清除·OH活性的构效关系。4_HCA衍生物的结构式见图1，各衍生物的结构和物理常数见表1。
 
    1 材料与方法

    1?1 仪器与试剂IFFM_E型化学发光分析仪(西安瑞迈公司，)；4_HCA衍生物(本研究组合成)；邻菲罗啉(上海生工生物工程技术服务有限公司，中国，分析纯)；抗坏血酸［中国医药(集团)上海化学试剂公司，中国，分析纯］；其他试剂均为分析纯。

    1?2实验方法

    1?2?1溶液配制FA、Ⅱa～Ⅱi用无水乙醇配制成不同浓度的溶液，浓度分别为：FA、Ⅱb、Ⅱd、Ⅱe、Ⅱf：0?008、0?04、0?2、1mmol/L；Ⅱc、Ⅱg：0?04、0?2、1、5mmol/L；Ⅱa：0?2、0?8、3?2、12?8mmol/L；Ⅱh：0?2、0?7、2?45、8?75mmol/L；Ⅱi：0?2、2mmol/L。邻菲罗啉水溶液(1?0×10-3mmol/L)用时现配，50～60℃水浴溶解；抗坏血酸水溶液(1?0×10-3mmol/L)用时现配；H2O2溶液(0?3％)用时现配；硫酸铜水溶液(1?0×10-3mmol/L)；硼砂_硼酸缓冲液(pH 9?0)。

    1?2?2 4_HCA衍生物清除·OH的测定

    向10mL烧杯中依次加入1mL硼砂_硼酸缓冲液、100μL邻菲罗啉水溶液、50μL CuSO4溶液、50μL待测样品溶液(空白组用等量双蒸水代替)、20μL抗坏血酸水溶液，最后加入100μL体积分数0?3％的H2O2，混匀，启动发光。室温下连续测定发光强度，记录峰值读数(P)。 清除率＝(P空白-P加药)/P空白×100％。

   1?3 统计学处理用SPSS 12?0统计软件，±s表示平均清除率(平均抑制率)，用Probit模块求出半抑制浓度(IC50)。

    2 结果

　　4_HCA衍生物对·OH的清除能力有较大差异，除Ⅱi外其他化合物对·OH清除率都具有量效关系。以IC50作为评价指标，4_HCA衍生物清除·OH能力的构效关系可归纳为①酚羟基单侧邻位烷氧基(_OCH3,_OC2H5)取代可显著提高4_HCA的抗·OH活性，FA、Ⅱe＞Ⅱa；②单侧邻位_Br取代后的活性与未取代的4_HCA的活性相当，Ⅱh≈Ⅱa；③单侧邻位_NO2取代时活性完全消失，Ⅱi无清除·OH活性；④在单侧邻位烷氧基取代(_OCH3,_OC2H5)的基础上于酚羟基另一侧的邻位引入_OCH3、_Br可提高化合物清除·OH活性，Ⅱb、Ⅱd＞FA ，Ⅱf＞Ⅱe；但引入_NO2会降低活性，Ⅱc＜FA，Ⅱg＜Ⅱe。FA、Ⅱa～Ⅱi对·OH的清除率及IC50值见表2及图2。

    3讨论

    3?1邻菲罗啉化学发光原理(图3)经Fenton反应产生·OH，可以氧化邻菲罗啉使其激发。当激发态邻菲罗啉返回基态时，产生化学发光(CL)，测定发光的强度，可间接反应体系中·OH的产生量。自由基清除剂清除·OH后，邻菲罗啉被氧化的程度减弱，导致发光强度降低，因此可用发光强度的减弱程度评价自由基清除剂的抗自由基能力。

    3?2酚类物质抗自由基作用机理主要是通过酚羟基与自由基反应生成稳定的苯氧自由基而终止自由基的链反应。因此，酚类物质的抗自由基活性一方面与O_H键的键能有关(键能越高，酚羟基的抽氢反应活性就越低，即物质的抗氧化能力越低)，另一方面与所产生的苯氧自由基的稳定性密切相关。化合物的结构因素若可稳定苯氧自由基，则可增强酚的抗氧化能力，杂原子的P型孤对使苯氧自由基通过共振作用得以稳定从而提高抗自由基能力，苯环上供电子基取代有利于苯氧自由基的稳定而提高抗氧化活性，相反，吸电子基会降低苯氧自由基稳定性而削弱抗自由基活性［7，8］。酚类物质清除·OH的过程见图4。

    3?3本文所研究的4_HCA衍生物清除·OH的活性基团是酚羟基而不是酚羟基对位的_CH=CH_COOH［3］。它是一个给电子基，通过共振作用稳定了苯氧自由基， 该类化合物是一类良好的抗氧化剂。

    3?4 4_HCA的酚羟基单侧邻位上引入不同取代基时①烷氧基的给电子共轭效应稳定了苯氧自由基，清除·OH活性增强，FA 、Ⅱe＞Ⅱa；②溴的p_π共轭效应抵销了溴的吸电子效应，所以活性基本保持不变(Ⅱh≈Ⅱa)；③_NO2是强吸电子基，严重削弱4_HCA清除·OH的活性，Ⅱi无抗自由基活性。

    3?5酚羟基单侧邻位烷氧基取代时清除·OH活性大为提高，在此基础上在酚羟基的另一侧邻位上引入取代基时①引入给电子基_OCH3时，活性进一步增大，Ⅱd＞FA。②引入吸电子基_NO2时活性都大大降低，Ⅱc＜FA，Ⅱg＜Ⅱe。③引入_Br时活性增强，Ⅱb＞FA、Ⅱf＞Ⅱe，可能是因为_Br的共振给电子作用而进一步增强了苯氧自由基稳定性，抗氧化活性进一步提高。综上所述，化学结构不同的4_HCA衍生物体外清除·OH的能力有较大差异，4_HCA苯环上3、5位取代基的引入可明显地影响此类化合物抗·OH活性，甲氧基和乙氧基能明显提高活性，溴次之，硝基则降低活性。

【】
  ［1］方允中, 郑荣梁. 自由基生物学的理论与应用［M］. 北京: 出版社, 2002. 31-33.

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