实时FQ－PCR与时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎分析
作者：薄红霞 冯育英 韩红燕 刘佳
摘 要 目的：探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)定量检测乙型肝炎病毒(HBV-DNA)与时间分辨荧光免疫分析法对乙型肝炎免疫标志物(HBV-M)检测对乙型肝炎实验室诊断的敏感性。方法：采用两种方法分别对800例本院传染科住院及门诊可疑病人血清标本进行检测。结果：用FQ-PCR 检测800例，HBV-DNA阳性例数602，阳性率 87.81%，用时间分辨荧光免疫分析法检测800例，HBV-M的阳性例数477，阳性率59.63%，通过χ２检检，χ２=2.98，P<0.05。结论：在乙型肝炎的实验室诊断中，FQ-PCR检测乙型肝炎病毒HBV-DNA更优于时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎免疫标志物HBV-M。关键词 乙型肝炎；聚合酶链反应；时间分辨荧光免疫分析
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是严重危害人类健康的病毒之一，HBV感染后血清免疫学标志物如HBsAg、HBsAb、HBeAg、 HBeAb、HBcAb(即乙肝两对半；HBV-M)等，它们的敏感性及特异性可满足一般临床应用。但近几年研究发现由于一些HBV变异株的出现导致临床部分患者的HBV感染复制状况难以判断，甚至漏检。定量PCR检测HBV-DNA可对乙肝患者体内HBV复制有更直接的了解，亦有利于临床对HBV感染的诊断、方案的选择及疗效判定。本实验采用荧光定量PCR(FQ-PCR)和时间分辨两种方法同时检测了800份肝炎患者血清，并对结果进行了对比观察，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象：
为2005年10月～2005年12月本院传染科住院及门诊病人800例。
1.1.2 试剂与仪器：
实时FQ－PCR试剂盒购自中山医科大学达安基因股份有限公司。DNA扩增仪为美国产ABI7000。 时间分辨荧光免疫分析法试剂盒购自上海新波技术有限公司，HBV－M仪器为上海新波生物技术有限公司生产的时间分辨荧光免疫分析。
1.2 方法
1.2.1 标本采集与保存：
无菌抽取受检者静脉血2mL，8,000rpm离心5min，吸取上清（注意勿带入红细胞）。标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测。
1.2.2 标本的处理和DNA的提取：
取血清标本50μL，加等量DNA提取液打匀，恒温金属浴10min(误差不超过1min)。10,000rpm离心5min，取上清液5μL做PCR反应。
1.2.3 标准品稀释和处理：严格按照HBV-DNA FQ-PCR试剂盒说明书将阳性定量质控标准品进行稀释和处理，最后与标本一同点样上机。
设置PCR程序为93℃2min预变性，然后按93℃45s→55℃60s ，先做10个循环，最后按93℃30s→55℃45s，做30个循环，所有检测均由同批检测人员进行操作及分析。
2 结果
HBV-DNA定量测量结果：800例肝炎患者血清标本中，350例HBV-DNA阳性，450例阴性，阳性最低滴度为2.74×103copies/mＬ，最高滴度为8.73×108copies/mＬ。其中乙肝大三阳组HBV-DNA检出率为95.83％；乙肝小三阳组HBV-DNA 检出率为43.48％；HBsAg、HBcAb(+)组HBV-DNA检出率高达40.00％；所有HBsAb(+)组均未检出HBV-DNA；HBV-M全阴组HBV-DNA 检出率为2.17％。见表1～表3。表1 用FQ-PCR检测病人HBV-DNA的结果HBV-DNA定量测定值范围（略）注：试剂盒的检测下限<103为阴性。表2 用时间分辨荧光免疫分析法检测病人HBV-M的结果（略）表3 两种方法对乙型肝炎患者血清标本检验结果比较（略）
3 讨论
通过上述两种方法对800例临床血清标本的检测，FQ-PCR检测HBV-DNA的阳性检出率87.81%,用时间分辨荧光免疫分析法检测HBV-M的阳性检出率59.63%,两种方法的χ2检验,P<0.05,说明两种方法对乙型肝炎病毒的检测有明显的差异。
在216例乙肝大三阳患者血清中检出HBV-DNA阳性207例，检出率达95.83％，定量结果在1.82×106copies/mＬ～8.73×108copies/mＬ之间，说明“大三阳”与HBV-DNA是有显著相关的。但是，不同个体病毒复制程度差异较大，其中有9例HBeAg阳性但HBV-DNA定量检测结果阴性，这9例服用拉米夫啶进行抗病毒者，使HBeAg阴转明显滞后，所以“大三阳”与HBV-DNA并不能划上等号，在抗病毒治疗过程中，两者均获得转阴，可认为抗病毒治疗疗效显著；如果其中一项阴转，则说明有效，但仍需继续抗病毒治疗，直到两项病毒指标都转阴为止。故虽然HBeAg(+)与HBV-DNA具有良好一致性，但检查HBV-DNA则是更为直接、及时的判断抗病毒疗效的依据。
161例乙肝小三阳患者血清中的70例检出HBV-DNA，检出率达43.48％，定量结果均值亦达5．11×108copies/mL，说明抗HBe的存在并不表示患者体内没有病毒复制。研究发现乙肝病毒容易“突变”(即它的基因发生变异)，造成病毒e抗原停止表达，转换成“小三阳”，实际上该类患者体内的HBV-DNA仍然存在活跃的复制，其传染性仍很强，且变异后的病毒更不易清除，也更容易进展到肝硬化，这种情况可能要比“大三阳”危害更大，所以更应做HBV-DNA定量分析，以确定是否需要治疗和观察抗病毒疗效。
总之，我们的结论是FQPCR检测乙型肝炎病毒HBV-DNA更优于时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎免疫标志物HBV-M。在临床上有条件的实验室尽可能采用该方法对乙型肝炎病毒检测。
［１］骆抗先，何超，周荣，等．聚合酶链反应对单一抗HBc阳性的乙型肝炎病毒携带者的检测．中华医学杂志，l992,72(1):11．
［２］Rodriguez F F．Hepatitis Virus infection mutants andits relation to viral genotypes and core mutants．Hepatology，l995，22(11)：64１．
［３］Garman W F．Mutation preventing formation of hepatitisantigen patients with chronic hepatitis B．Lancet，l989，1１(6)：588．
［４］王平忠．HBV-DNA与HBV-M检测结果的对比分析．中华实验和临床病毒学杂志，l999，１3(4)：344.
［５］Manns MP.Current state of interferon therapy in the treatment or chronic hepatitis B (J).semin Dis,2002,22(Suppl 1)：7.
［６］吴林慧.400名献血员HBV标志物检测结果分析浙江预防医学，1996，1(2)：41．
