慢性乙型肝炎患者树突状细胞培养与功能检测方法

【摘要】  目的: 建立从人外周血分离培养树突状细胞（dendritic cell，DC）及检测其表型与诱导淋巴细胞增殖能力的方法。方法:从未接受抗病毒的CHB患者外周血中分离单个核细胞，在含GM-CSF、IL-4、TNF-α的完全培养基中诱导培养为DC，流式细胞仪检测细胞表型，混合淋巴细胞反应检测DC刺激淋巴细胞增殖的能力。结果:CHB患者外周血单核细胞，在体外可诱导出具有典型形态及生物学活性的DC。患者DC的HLA-DR、CD80、CD86的表达率分别为（44.77±8.127）%、(36.65±6.867）%、（32.16±6.340）%，CHB患者DC刺激淋巴细胞增殖的SI为1.39±0.375。与正常人DC相比明显降低（P<0.01）。结论:CHB患者单个核细胞能被诱导培养为DC；通过检测DC表型和刺激淋巴细胞增殖能力可以了解CHB患者抗HBV免疫功能。

【关键词】  树突状细胞 慢性乙型肝炎 免疫状态

    Abstract  Objective：To establish the method of culturing DC from human peripheral blood and testing the phenotype and the capacity of stimulating leukocyte. Methods：Selecting CHB without receiving antiviral treatment,PBMCs were separated from peripheral blood，and then cultured in vitro with medium containing GM-CSF IL-4 TNF-αinto DC. The phenotype of DC was identified by flow cytometry. The abilities to stimulate T cell proliferate were detected by mixed leukocytes reaction (MLR). Results: PBMC from CHB patients which were cultured in vitro could be induced into typical DC. The expression of costimulating molecules CD80、CD86、HLA-DR in the surface of DCs from CHB patients before antiviral treatment were (32.16±6.340)%、(36.65±6.867)%、(44.77±8.127)%.The stimulation index (SI) that DC stimulate lymphocytes to proliferate was 1.39±0.375.Conclusion:The PBMC from CHB patients could be induced into DC. Testing the phenotype and the capacity of stimulating leukocyte of DC from CHB can be known the ability of antiviral immunity.

    Key words  Dendritic cell；Chronic hepatitis B；Immunitic situation

    机体特异性免疫反应的产生，是由抗原提呈细胞（APC）捕获抗原，在其对抗原处理后将抗原信息提呈T、B淋巴细胞后引发的。树突状细胞（dendritic cell，DC）是功能最强大的专职的抗原提呈细胞，在机体的免疫反应中起着重要作用［１，２］。HBV持续感染与多方面因素有关，其中患者DC功能低下，抗原提呈能力下降，不能正常诱导机体抗HBV免疫反应是最重要因素之一。HBV持续感染患者仅产生弱的HBV特异的细胞毒性淋巴细胞反应（CTLs），导致HBV病毒不能清除和慢性乙型肝炎的迁延不愈。检测和通过治疗改善患者的DC功能在乙肝免疫治疗中有重要意义。本实验拟建立从人外周血分离培养DC及检测其表型与诱导淋巴细胞增殖能力的方法，并对HBV 感染的慢性肝炎患者体内DC功能进行了检测。

    1  材料与方法

    1.1  病例选择

    选择慢性乙型病毒肝炎10例，男7例，女3例，年龄18岁～50岁，血清丙氨酸转氨酶（ALT）在69 U/L～515 U/L，平均值为182 U/L，6个月内均未使用过抗病毒药物，所有病例参照2005年慢性乙型肝炎防治指南的诊断标准［３］。7名健康志愿者作为正常对照。

    1.2  主要试剂

    RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品。rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a购自晶美公司，为Peprotech公司产品。 MTT、丝裂霉素C、 HEPES、L-谷氨酰胺为Sigma公司产品。PE荧光标记鼠抗人HLA-DR、CD80、CD86单抗为美国BD公司产品。淋巴细胞分离液（F-K液）为上海荣盛生物试剂厂产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。

    1.3  实验方法

    1.3.1  树突状细胞的体外诱导培养：参照Romani等人分离培养的方法［４］。采集外周血10 mL，抗凝后置于无菌试管中，用温热的PBS将抗凝血稀释1倍后，轻轻加在淋巴细胞分离液面上成界面。2 000 rpm离心20 min，收集血清底部与淋巴细胞分离液顶部之间的白膜层，即单核细胞（PBMC）。用预热的约5倍体积的PBS液，分别以1 500 rpm、1 000 rpm、1 000 rpm离心5 min洗涤3次，洗尽血小板。用RPMI 1640完全培养基悬浮沉淀细胞，吸管吹打混匀，调整细胞浓度为1×106/mL，移入6孔板中。37 ℃、5%CO2孵箱中孵育2 h后，弃去上清，再用预热的培养液轻轻清洗贴壁细胞，弃去培养液，加入RPMI 1640完全培养基，每孔1 mL，按rhGM-CSF （1 000 U/mL）、rhIL-4（1 000 U/mL）终浓度加入细胞因子，置37 ℃、5%CO2孵箱培养，隔日半量换液一次，同时补加细胞因子，于培养第7 d补加TNF-α（1 000 U/mL），共培养9 d。

    1.3.2  DC功能的检测：对DC功能检测包括检测其表面共刺激分子的表达和刺激淋巴细胞增殖的能力。前者主要用流式细胞仪检测DC表面CD80、CD86、HLA-DR的表达。后者主要采用混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC与淋巴细胞共同孵育后淋巴细胞的增殖情况。

    FACS检测DC表面分子的表达。收集DC，1 000 rpm，离心5 min。用PBS洗2次后制成细胞悬液，加入流式管中。加入PE标记的单抗10 μL，轻轻混匀。暗处孵育45 min，PBS洗1次，加入500 μL的PBS混匀，然后用流式细胞仪进行检测。

    DC刺激混合淋巴细胞反应（MLR），如上述实验，从外周血分离PBMC，37 ℃、5% CO2孵箱中贴壁2 h，收集悬浮细胞即为淋巴细胞，收集DC用50 mg/L的丝裂霉素C作用45 min。PBS洗涤3次，用RPMI 1640完全培养基悬浮细胞。以DC∶淋巴细胞为1∶10接种于96孔培养板中，使终体积为200 μL/孔，每个病人设3个复孔。对照组，只加入淋巴细胞孔与只加入DC孔。将上述细胞放入37 ℃、5% CO2孵箱中培养4 d，弃去上清，所有孔中加入MTT液20 μL。继续培养4 h～6 h后，所有孔均加入150 μL DMSO溶液，振荡10 min，酶标仪测定OD值，刺激指数SI。SI=实验组的OD值/（DC对照孔的OD值 +淋巴细胞对照孔的OD值）

    1.3.3  统计学分析： 数据以均数±标准差表示，采用SPSS12.0统计学软件进行两样本的t检验，P<0.05为有显著统计学差异。

   2  结果(见表1、表2)

    外周血PBMC贴壁2 h后，粘附细胞大部分为单核细胞，圆形、较小，加入GM-CSF、IL-4培养，细胞逐渐聚集成簇状。以后部分细胞悬浮，培养至第5 d～7 d，可见到大量成簇状悬浮细胞，并随着培养时间的延长，细胞逐渐变大，突起逐渐延长。但慢性乙肝患者的DC突起较少，且具有突起的细胞较少（见图1，图2）。慢性乙型肝炎患者DC的HLA-DR、CD80、CD86的表达率分别为（44.77±8.127）%、（36.65±6.867）%、（32.16±6.340）%，CHB患者DC刺激淋巴细胞增殖的SI为1.39±0.375。表1  DC表面分子表达的比较表2  DC的刺激指数

    3  讨论

    DC是体内最强的抗原呈递细胞，成熟的DC可高表达MHC分子、协同刺激分子和粘附分子从而刺激初始型T细胞诱导初级免疫反应，同时通过分泌IL-12活化NK细胞，促进Th1型细胞因子IL-2、IFN-r的分泌，因此DC被认为是一种很强的天然佐剂，可诱导细胞毒性T细胞反应，在抗感染免疫过程中发挥关键性作用。以上均与相一致［５，６］。说明应用CHB患者外周血在细胞因子作用下诱导DC的方法已经建立。有研究表明，CHB患者体内的DC数量少、活性低，很可能是病毒持续感染的重要原因［７，８］。本实验结果表明，慢性乙型肝炎患者DC表面的MHC及共刺激分子减少和刺激T淋巴细胞增殖能力降低，与先前的结果相一致。    最近研究认为，DC发挥其功能并不是固定的、程序化的，而是随着外界环境信号的不同而变化。如在麻疹病毒感染时，DC功能下降，不能刺激同种异体T淋巴细胞增殖。Chisari发现HBV转基因小鼠DC功能正常，HBsAg特异性CTL存在，仅功能上处于静息状态，如果将经细胞因子活化的DC回输小鼠则可以打破免疫耐受，发挥抗病毒的CTL反应。CHB患者的DC虽然在功能上较正常人低，但仍能表达MHC和协同刺激分子，而且可刺激同种异体T细胞增殖，且与正常人一样，经过TNF-a的刺激后可分泌大量的IL-12，较未加因子刺激时增加近10倍。经免疫表位多肽诱导，慢性乙肝患者的DC可以在体外诱导特异性效应T细胞活化，并可分泌清除病毒的细胞因子。因此，建立从人外周血分离培养树突状细胞及诱导淋巴细胞增殖能力的方法，将为研究慢性乙型肝炎患者DC功能提供平台，用这种经诱导的DC回输至患者体内，可有望打破机体免疫耐受，从而有利于激活机体的特异性T细胞应答，增强机体清除HBV作用［９］。

【文献】
  ［１］ Shortman K,Liu YJ.Mouse and human dendritic cell subtypes. Nature Rev Immunol,2002,2(3):151～161.

［２］ Maldonado Lopez R,Moser M.Dendritic cell subsets and the regulation of Th1/Th2 responses.Semi,Immunol,2001,13:275～282.

［３］ 中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南.中华肝脏病杂志,2005,13:881～891.

［４］ Romani N,Gruner S,Brang D,et al.Proliferation dendritic cell prgenitors in human blood.J Exp Med,1994,180(1):83～93.

［５］ 刘树人,彭齐荣,李灼亮.慢性乙肝患者树突状细胞表型和抗原提呈能力的测定.医学杂志,2003,13(9):30～32.

［６］ 陈大为,张 政,张鸿飞,等.儿童慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞亚群的变化和临床特点.肝脏,2006,11(1):1～3.

［７］ Hilleman MR.Critical overview and outlook:pathogenesis,prevention,and treatment of hepatitis and hepatocarcinoma caused by hepatitis B virus.Vaccine,2003,21(32):4　626～4　649.

［８］ Bertoletti A,Gehring AJ.The immune response during hepatitis B virus infection.J Gen Virol,2006,87(6):1　439～1　449.

［９］ Chisari,Stumptner-Cuvelette P,Benaroch P.Multiple roles of the invariant chain in MHC class Ⅱfunction.Riochim Biophys Acta,2002,1 542:1～13.