5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素诱导人肝癌细胞生长抑制和凋亡

【摘要】  目的：研究5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素(ADFMChR)对人肝癌(SMMC-7721)细胞生长和凋亡的影响。方法：平皿克隆形成法测定细胞锚定依赖性生长能力；吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色荧光显微镜观察凋细胞亡形态,计数细胞凋亡；PI染色流式细胞术(FCM)分析细胞周期和凋亡率。结果：平皿克隆形成法显示：ADFMChR抑制人肝癌(SMMC-7721)细胞生长,且呈浓度依赖性。AO/EB染色荧光显微镜观察发现随着ADFMChR浓度的增加SMMC-7721细胞凋亡率依次增加。PI染色FCM结果表明ADFMChR以浓度依赖方式诱导SMMC-7721细胞凋亡，且使细胞周期阻滞于G1期。结论：ADFMChR具有诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用，其机制可能与细胞周期G1期阻滞相关。

【关键词】  肝肿瘤 白杨素 细胞周期阻滞 凋亡

    Abstrct  Objective:To investigate the effect of 5-ally-7-gen-difluormethylene-chrysin (ADFMChR) on the growth and apoptosis of human SMMC- 7721 cells cultured in vitro and its mechanism.Methods:SMMC-7721 cells were treated with various concentrations of ADFMChR.Cell proliferation of SMMC-7721 cells was evaluated by clone formation test.The morphology of cell apoptosis of SMMC-7721 cells were detected by AO/EB double fluorescence stain.The apoptosis rate and cell cyle of SMMC-7721 cells were determined by PI staining flow cytometry.Results:Data of colone formation test indicated that ADFMChR could inhibit the growth of SMMC-7721 cells in a concentration-dependent manner.PI staining flow cytometry and AO/EB double fluorescence stain showed that cell cyle was arrested at G1 phase and the apoptosis of  SMMC-7721 cells was induced by ADFMChR in a concentration-dependent manner.Conclusions:ADFMChR posseses induction of apoptosis of SMMC-7721 cells in vitro,and its mechanism might be associated with G1 phase cell cycle arrest.

    Key words  Human liver cancer；Chrysin；Cell-cycle arrest；Apoptosis

    白杨素（ChR)具有抗氧化［１］，抗病毒［２］，抗高血压［３］，抗糖尿病［４］，抗基因突变［５］和抗肿瘤等作用［６］。但因其肠道吸收甚少和5,7位羟基被迅速糖基化代谢导致生物利用度和体内活性降低,限制

    了它的临床应用。我们以往的实验研究证实：5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素(ADFMChR)具有显著抑制人胃癌细胞和人结肠癌细胞增殖作用。本实验研究ADFMChR抑制SMMC-7721细胞生长和诱导凋亡作用。

    1  材料与方法

    1.1  受试物和试剂

    5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素(ADFMChR)，由湖南师范大学药学系药物合成化学教研室合成，分子量：259；性状：黄色粉末状；纯度：98％。白杨素购于美国Sigma公司。PRMI－1640培养基为美国Gibco公司产品；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；二甲基亚砜（DMSO）为美国Amresco公司产品。

    1.2  细胞与细胞培养

    人肝癌细胞系(SMMC-7721)购于院上海细胞生物研究所(中国上海市)。用含10%小牛血清的RPMI-1 640培养基于37 ℃，5%CO2混合气体，95%湿度的培养箱内培养，取对数生长期细胞用于实验。

    1.3  平皿克隆形成法

    取对数生长期细胞，调节细胞密度为1×103/mL。接种于24孔板，每孔0.45 mL。培养6 h待细胞贴壁后，分别加入50 μL的ADFMChR和ChR并使其终浓度分别为0.3 μM、1.0 μM、3.0 μM、10.0 μM、30.0 μM；5-Fu 2 μg/mL，并且设立空白对照组，每个浓度设3个复孔，每隔两天换加药的培养基，培养6 d，观察细胞形成的克隆集落数，集落抑制率IR%=(1-处理组集落均数/对照组集落均数) ×100%，并Mosmann法其IC50值，以上实验重复三次。

    1.4  AO/EB染色荧光显微镜观察

    取对数生长期SMMC-7721细胞，分别加入ADFMChR并使其终浓度分别为1.0 μM、3.0 μM、10.0 μM，ChR终浓度为30.0 μM，5-Fu 2μg/mL，继续培养48 h后收集细胞1×107，离心，1 000 rpm×5 min，PBS溶液重悬细胞洗涤，离心3次。制成95μL单细胞悬液，加入5μL AO/EB染液，充分混匀，吸一滴放于洁净盖玻片上，直接用盖玻片封片，在荧光倒置显微镜下观察细胞形态变化，并且分别计数200个细胞,凋亡指数(%)＝［（早期凋亡细胞＋晚期凋亡细胞）/200］×100%。

    1.5  PI染色流式细胞术（FCM)

    收集SMMC-7721细胞2×107，1 000 rpm×5 min离心，用4 ℃预冷的PBS溶液重悬细胞，离心，1 000 rpm×5 min,重复一次。将收集的细胞团用4 ℃预冷的75%乙醇固定细胞24 h置冰盒中送检。用（流式细胞仪）（ Beckerman coulfer EPICS-XL）进行细胞周期和DNA含量分析。

    1.6  统计学处理

    采用SPSS10.0统计分析软件，One Way ANOVA方式行方差分析，两两比较采用Students’t检验进行分析，数值用x±s表示，确定P<0.05为差异有显著性意义。

    2  结果

    2.1.  ADFMChR对SMMC-7721细胞集落形成能力的影响

    经过0.3 μM的ADFMChR和ChR处理的SMMC-7721细胞集落抑制率分别为21.33%、9.09%；30.0 μM的ADFMChR和ChR处理组细胞的集落抑制率分别为84.23%、71.12%。与对照组相比ADFMChR对SMMC-7721细胞集落形成均有抑制作用(P<0.05)，2 μg/mL的5-Fu的集落抑制率为99.93%。ADFMChR对人肝癌SMMC-7721细胞生长抑制的IC50值为3.56 μM；ChR的IC50值是9.28μM，说明ADFMChR抑制人肝癌SMMC- 7721细胞的生长，其作用强于先导化合物ChR。见图1。

    2.2.  AO/EB染色荧光显微镜观察ADFMChR对SMMC-7721细胞凋亡的影响

    荧光显微镜下观察早期凋亡细胞，细胞形态接近正常，胞质为绿色略带红色，核呈桔红色，核形态基本正常；晚期凋亡细胞，细胞体积缩小或呈圆形，胞质呈红色，核呈红色，核固缩或碎裂(见图2)。SMMC-7721细胞的凋亡率为(1.12±0.12) %，1.0 μM、3.0 μM和10.0 μM的ADFMChR处理组的凋亡率分别为(1.24±0.17) %(P>0.05 VS control)、(5.61±0.42) %、(23.46±0.82) %（P＜0.05 VS control）；说明ADFMChR可诱导SMMC- 7721细胞凋亡，且呈浓度依赖性。

    2.3.  PI染色FCM分析ADFMChR对SMMC-7721细胞细胞周期和凋亡的影响

    DNA直方图示：G0/G1期前出现一个代表细胞凋亡的亚G1期峰，对亚G1期峰进行定量分析，可了解凋亡细胞的比率。处理组的凋亡率变化与AO/EB荧光双染法所测结果一致。细胞周期分析结果表明1.0 μM、3.0 μM和10.0μM的ADFMChR处理SMMC-7721细胞48 h后，其G1期细胞分别56.3%、60.9%、64.2%。较对照组G1期细胞45.9%明显提高（P＜0.05 VS control），反映有G1期阻滞现象(见图3)。

    3  讨论

    白杨素(5,7-二羟基黄酮)是一种具有广泛药理活性的黄酮类化合物。其抗肿瘤作用主要表现在［７，８］。①抗细胞增殖作用主要使细胞周期停止，对肿瘤细胞有毒性作用，对正常细胞无毒性或致突作用，反而有抗氧化作用和正向的免疫调节作用；②诱导细胞凋亡；③抑制细胞信号转导过程中的酪氨酸蛋白激酶C和磷脂酰肌醇3-激酶活性；④增强抑癌基因活性及表达等功效。

    本文实验采用平皿克隆集落形成法检测ADFMChR对人肝癌细胞生长的影响。结果证实ADFMChR能抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长，且呈浓度依赖性。ADFMChR抑制SMMC-7721细胞生长作用效价强度是先导化合物CHR的2.6倍，说明ADFMChR抑制人肝癌细胞生长作用具有相对选择性。此外，本文实验的AO/EB染色荧光显微镜观察发现ADFMChR 3.0 μM诱导SMMC-7721细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变，细胞体积明显变小，结构模糊，呈致密的橘黄色或橘红色，可见胞浆减少，核碎裂和核裂解成数个大小不等的黄绿色碎片，细胞核染色质固缩、偏向一侧聚集在胞膜下，成月芽状，胞膜出芽改变。随着ADFMChR的浓度高至10.0 μM时，可见已经破碎的核和凋亡小体形成。说明ADFMChR可诱导SMMC- 7721细胞凋亡，呈浓度依赖性。

    本文PI染色FCM分析表明：ADFMChR诱导细胞凋亡程度和细胞周期G1细胞百分率呈正相关。因此，阻滞SMMC-7721细胞周期进程和诱导肿瘤细胞凋亡是其抗人肝癌作用的主要方式。

    总之，本文实验证实含氟白杨素衍生物ADFMChR具有显著抑制人肝癌细胞生长和诱导凋亡作用，其作用强于先导化合物ChR。为寻找人肝癌候选药物提供了有实际价值的实验依据。

【】
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