早期糖尿病大鼠心肌NOS系统与胶原纤维演变的实验研究

【摘要】  目的：观察不同时期糖尿病（diabetes mellitus,DM）大鼠血清、心肌组织中NO、NOS水平及心肌胶原纤维的变化，探讨NO与心肌胶原纤维的相关性。方法：应用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射建立SD大鼠糖尿病模型，设立正常对照组（1个月、2个月和3个月）和模型组（1个月、2个月和3个月）。测定各组大鼠血清、心肌匀浆中的NO含量及NOS活性，利用Van Gieson 氏胶原纤维染色法观察各组大鼠心肌胶原纤维的变化。结果：DM大鼠血清、心肌中的NO、NOS水平较正常组显著降低（P<0.05）并随着糖尿病病程的延长不断降低，心肌胶原纤维在糖尿病组明显增生，而且也随着病程的延长不断加重。结论：DM大鼠心肌胶原纤维的增生与细胞中NO及NOS水平的减少有关。

【关键词】  心肌病变 一氧化氮（NO） 糖尿病 链脲菌素 胶原纤维

    Abstract  Objective: To observing the levels of NO and NOS and of blood serum and cardiac muscle in diabers mellitus ,during different periods and study the correlation between NO and collagen fibers in cardiac muscle. Methods: SD rats were divided into normal group (one month, two months and three months) and modal group (one month, two months and three months) .Modal rats were injected into intraperitoneally by streptozotocin(STZ). Then to test the levels of NO and NOSese in all group rats . At last , to observe the changes of collagen fibers in all group rats in cardiac muscle by Van Gieson collgen fiber dye. Results: The levels of NO and NOS in DM blood serum and cardiac muscle decrease noticeably compared to normal groups (P<0.05).What’s more with the extension of DM,the levels continue to drop.Also,collagen fibers in cardiac muscle in crease evidently in DM groups and continue to grow as DM lasts a longer time.Conclusion:The increase of collagen fibers in cardiac muscle is related to the drop of the levels of NO and NOS in cells.

    Key words  Diabetic cardiomyopathy (DC)； Nitric oxide(NO)； Diabetes mellitus(DM)；Streptozotocin(STZ)；Collagen fibers (CF)

    糖尿病心肌病变（diabetic  cardiomyopathy, DC）是糖尿病常见的一种并发症，临床表现为心力衰竭，心律失常，心源性猝死，是糖尿病主要死亡原因之一。近年来的研究发现胶原纤维增生是引起糖尿病心肌病变的原因之一。已往对胶原纤维的研究多在缺血再灌注方面，而NO对胶原纤维的影响方面研究的较少，因此，我们就这方面进行了研究，现报导如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  药物与试剂：链脲佐菌素（美国SANLAN),NO、NOS试剂盒（南京建成生物工程研究所）、三氯化铁（上海星山化工厂）、苏木精（上海化学试剂公司进口分装）、苦味酸（上海化学试剂公司）、酸性品红（上海新中化学厂）。

    1.1.2  动物：SD雄性大鼠42只，体重180 g～200 g由福建医科大学实验动物中心提供,合格证号：闽物质检号（2002-2006）。

    1.2  方法

    1.2.1  动物分组与模型：SD雄性大鼠42只适应性喂养1 W，随机取出21只为正常对照组（腹腔注射等体积生理盐水1个月、2个月、3个月各7只），另外21只大鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后尾静脉采血测定血糖，血糖大于16.7 mmol/L者为糖尿病模型动物。成型模型组分为三组①糖尿病1个月组②糖尿病2个月组③糖尿病3个月组（按250 mg/kg，1次/d灌胃）各7只（糖尿病3个月死亡1只，糖尿病1个月死亡1只）。各组大鼠均以颗粒饲料喂养，自由进食、饮水。

    1.2.2  取血和制备心肌匀浆：分别在1个月、2个月和3个月后取各组大鼠6只静脉取血置于4 ℃冰箱冷藏待测，用乌拉坦（按1 g/kg）麻醉处死，迅速取心肌组织置于4 ℃预冷生理盐水洗净血液，用滤纸吸干水份后称重，以4 ℃生理盐水制成10%匀浆，4 ℃下3 000 r/min离心15 min，取上清液置于4 ℃冰箱冷藏待测。

    1.2.3  血清和心肌组织中NO、NOS的测定：NO用硝酸还原酶法测定，NOS用化学比色法测定，蛋白质用考马斯亮兰法测定。测定步骤按试剂盒说明严格操作。

    1.2.4  Van Gieson 氏胶原纤维染色：用乌拉坦（按1 g/kg）麻醉处死大鼠后，迅速取各组大鼠心肌组织用4 ℃预冷生理盐水洗净血液后用10%甲醛固定，经脱水、包埋后切片以Van  Gieson 氏胶原纤维染色后在光镜下观察胶原纤维。

    1.2.5  统计学处理：实验数据以（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析（one -way SNOVA） ，所有数据采用机软件SPSS 10.0 统计分析。

    2  结果

    2.1  血清中NO含量及NOS活性的测定

    正常组三个组血清中NO含量及NOS活性几乎不改变（P>0.05），无统计学意义。糖尿病模型组血清中NO含量及NOS活性随着病程增加越来越低(P<0.01），糖尿病模型与正常组比较显著降低（除模型组1与正常组3比较P<0.05，其他都是P<0.01）具有统计学意义。各组大鼠血清中NO含量及NOS活性的变化见表1。表1  各组大鼠血清中NO含量及NOS活性的变化注：模型组正常组比较*P<0.05，其他都是**P<0.01，##P<0.01与模型组1个月比较

    2.2  心肌组织中NO含量及NOS活性的测定

    正常组三个组心肌组织中NO含量及NOS活性几乎不改变（P>0.05），无统计学意义。糖尿病模型组血清中NO含量及NOS活性随着病程的延长越来越低(P<0.01），有统计学意义。各糖尿病模型组与正常组比较有较显著降低(P<0.01），具有统计学意义。各组大鼠心肌匀浆中NO含量及NOS活性的变化见表2。表2  各组大鼠心肌匀浆中NO含量及NOS活性的变化   注：模型组与正常对照组比较**P<0.01,与模型组1个月比较##P<0.01

    2.3  心肌胶原纤维结果(见图1～图3)

    Van Gieson 氏胶原纤维染色法。糖尿病模型组在间质及血管周围胶原纤维明显增多，着色较深较粗，血管周围的胶原环绕血管并与间质中的胶原纤维连成网状。还可观察到心肌肌原纤维断裂、萎缩，肌丝扭曲，结构紊乱，细胞间隙较大。细胞核增大，大小不均，深染（图2、图3）。1个月模型虽也有增生但胶原纤维较细、稀疏，细胞核颜色稍有加深（图1）。正常组肌原纤维排列致密、整齐。细胞核分布均匀，颜色较浅，胶原纤维分布稀疏、均匀（图4～图6）。

    3  讨论

    3.1  心脏结构的改变是引起心肌病的一个重要原因

    胶原纤维是心脏组成的一部分，胶原纤维代谢异常会导致心脏结构和功能的异常，心脏纤维化到一定程度会导致心力衰竭的发生［１］。胶原纤维的生成与很多因素有关。据报道［１］能促进胶原合成的因素有：血管紧张素Ⅱ型（AngⅡ）、醛固酮、内皮素，转化生长因子（TGF）-β1;能促使胶原降解的因素有：基质金属蛋白酶（M M PS）、缓激肽、前列腺素、NO、心房利钠肽（ANP）等。其中的NO是内皮细胞产生的一种信号传导物质，在平滑肌细胞中可激活鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase,GC)GC催化GTP生成cGMP，cGMP激活蛋白激酶G,导致血管平滑肌松驰，使血管得到舒张，增加冠脉血流［２］、改善心肌缺血［３］，减轻心脏胶原蓄积，介导心脏自主神经对心率和心肌收缩力的调控［４］，具有舒张血管调节血压作用。本实验结果发现糖尿病大鼠血清和心肌组织中NOS活性及NO含量较正常组明显下降，并且随着病程的延长，下降的更明显，而且通过Van  Gieson 氏胶原纤维染色法，可看到心肌间质及血管周围胶原纤维深染增多与周丽诺［５］等的报道一致，随着病程的延长，胶原增生不断加重。我们认为胶原纤维的增生与血清及心肌组织中NO的减少有关。这可能是由于糖尿病大鼠长时间体内代谢紊乱，造成内皮细胞受损，破坏内皮细胞中NOS的活性，而NO是由NOS氧化L-Arg的胍基产生，所以该酶活性降低导致NO的合成和分泌减少，同时NADPH是NOS和谷胱甘肽还原酶的辅助因子，糖尿病时，后者酶活性增强，NADPH被竞争性消耗，使NOS活性被抑制，NO合成减少，从而使血管舒张障碍，张力增加，造成缺血［６］。Kato等［７］发现NO分泌减少，促进诱发血管紧张素Ⅱ增生，张琳等［８］研究发现AngⅡ能增进胶原纤维合成增生。血管周围增生的胶原纤维环绕在血管外壁，使心脏的硬度增加失去弹性，影响心脏的收缩和舒张功能，导致心脏搏出量减少，同时使血管腔变窄，血流量变小，血液的粘稠度增加，血流速度缓慢，供能供氧不足，有研究发现糖尿病大鼠心肌细胞膜上Na-K-ATPase活性下降与NO减少有关［９］。能量供应不足使肌原纤维断裂、萎缩、间隙变大。可见，NO的减少是心肌胶原纤维增生的一个重要原因，也是影响心肌结构的一个重要因素，在糖尿病早期通过药物控制NO的浓度，对控制糖尿病并发症有一定的作用。

【】
  ［１］ 邓 玮,陈庆伟.心力衰竭与心脏胶原纤维,心血管康复医学杂志,2004,13（2）:198.

［２］ Khaidar A,Marx M,Lubec B,et al.L-arginine reduces heart collagen accumulation in the diabetic db/db mouse. Circulation,1994,90(1):479～483.

［３］ 姜 桢,郭克芳,董苏斐.左旋精氨酸与自由基的作用.临床麻醉杂志,2000,16（10）:503～505.

［４］ Trau O. Van- Bibber R.Role of nitric oxide in insulin-dependent diabetes mellitus-related vascular complicatilons. West J Med,1995,162(5):439～445.

［５］ 周丽诺,沈稚舟,吴 烯,等.STZ糖尿病大鼠心肌短型瘦素受体（Ob-Ra）的转录表达及心脏纤维化观察.复旦大学学报（医学版）,2002,29:458.

［６］ Cotter MA, Cameron NE. Correction of neurovascular deficits in diabetic rats by beta2-adrenoceptor agorist and alphal-edrenoceptor antagonist treatment :interactions with the nitric oxide system．［Ｊ］ Eur Jpharmacol (Netherlands),1998,343:217-23.

［７］ Kato H,Hou J.Chobanian AV.et al.Effects of angiotensin Ⅱ infusion and inhibition of nitric oxide synthase on the rat aorta.［Ｊ］Hypertension,1996,28:153～158.

［８］ 张 琳,周丽诺,吴 烯,等.血管紧张素Ⅱ及氯沙坦对糖尿病大鼠心肌成纤维细胞α1（Ⅰ）前胶原RNA和蛋白表达的影响,2005,13（2）:134.

［９］ 任 骏.糖尿病心肌病的基础与临床研究现状.心血管病变学进展,2001,22（5）:299～302.