HPLC法测定祛痹舒肩丸中阿魏酸的含量

                  作者：申强  陈燕忠 吕竹芬 庄义修   

【摘要】  目的：建立以高效液相色谱法测定祛痹舒肩丸中阿魏酸含量的方法。方法：色谱柱为C18柱（4.0 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙睛-0.085%磷酸溶液（17∶83），检测波长为323 nm，流速为1.0 mL/min,柱温为室温。结果：阿魏酸在（0.001996～0.07984）mg/mL范围内浓度与峰面积线性关系良好（r=0.9997,n=7），平均加样回收率为101.2%，RSD为2.9%（n=6）。结论：本方法简便、灵敏、准确，可用于祛痹舒肩丸的质量控制。

【关键词】  高效液相色谱法 祛痹舒肩丸 阿魏酸

    Abstract  Objective:To develop a HPLC method for determination of ferulic acid in Qubi Shujian Pills.Methods:The analysis was carried out on a Diamonsil C18 column (4.0 mm×250 mm，5 μm) with a mobile phase acetonitrile-0.085% phosphoric acid (17∶83). The flow rate was 1.0 mL/min at the room temperature and the UV detection wavelength was 323 nm.Results:The calibration curve was linear at the range of（0.001996～0.07984）mg/mL for the ferulic acid (r=0.9997,n=7).The average recovery rate was 101.2% and RSD was 2.9%  (n=6).Conclusion: The method was rapid, sensitive and accurate, and could be used for the quality control of this preparation.

    Key words  HPLC;Qubi Shujian Pills;Ferulic acid

    祛痹舒肩丸是由桂枝、羌活、黄芪、三七、当归等十四味中药组成的中药复方制剂，临床主要用于肩关节性周围炎，以治疗风寒痹为主［１］。本品原质量标准中无阿魏酸的含量测定方法，不利于制剂的质量控制。本文参照《药典》［２］，建立了HPLC法测定祛痹舒肩丸中的阿魏酸的含量。本法操作简便，灵敏度高，重现性好，结果准确可靠，可作为该药的质量控制标准。

    1  仪器与试药

    Dionex P680高效液相色谱仪，Dionex UVD170U可变波长检测器，Chromeleon色谱工作站，Sartorius BS224S分析天平，UV-1101紫外可见分光光度计，KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器。阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110773-200611，供含量测定用），祛痹舒肩丸（汕头市麒麟药业有限公司，批号：890906，9911011，20060602，20060610），乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件

    色谱柱为Dikma Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Phenomenex C18保护柱（4.0 mm×2.0 mm）。流动相为乙睛-0.085%磷酸溶液（17∶83），流速为1.0 mL/min，检测波长为323 nm，柱温为室温，进样量为20 μL，理论塔板数按阿魏酸峰应不低于3 000。

    2.2  溶液的制备

    2.2.1  对照品溶液的制备：精密称取减压干燥过夜(室温下)的阿魏酸对照品9.98 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.3992 mg/mL对照品溶液。

    2.2.2  供试品溶液的制备：取祛痹舒肩丸2 g，研细，精密称取粉末1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（1∶20）溶液20 mL，称定重量，超声处理10 min，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇（1∶20）溶液补足减失的重量，摇匀，用0. 45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

    2.2.3  阴性对照液的制备：按制剂处方组成除去当归后，根据样品制备工艺制备阴性对照，按供试品溶液制备方法制成不含当归的阴性对照溶液。

    以上3种溶液按上述色谱条件进样，测定。结果供试品色谱图中与对照品色谱图中相应位置上有一相同保留时间的色谱峰，阿魏酸峰与其他组分峰分离度良好，阴性对照无干扰。结果见图1～图3。

    2.3  标准曲线及线性关系考察

    上述色谱条件下，精密吸取上述对照品溶液0.05 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.5 mL，1.0 mL，2.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，取上述系列浓度对照品溶液，分别进样20 μL。以阿魏酸对照品峰面积积分值Y（mAU/min）对对照品溶液浓度X (mg/mL)进行线性回归，得回归方程：Y=1720.8X+0.3417，相关系数为r=0.9997 (n=7)。可见阿魏酸在0.001996 mg/mL～0.07984 mg/mL范围内线性关系良好。

    2.4  精密度试验

    分别吸取同一对照品溶液，连续进样6次，每次20 μL。所测得阿魏酸峰面积积分值的RSD为0.68%(n=6)，表明仪器精密度良好。

    2.5  重复性试验

    取同批丸剂样品（批号：890906），按2.2.2项下平行操作制备成6份供试品溶液后按样品测定项下方法测定，平均含量为2.014 mg/g，RSD为0.74%(n=6),表明本方法重复性良好。

    2.6  稳定性试验

    取同一供试品溶液（批号：890906），分别于制备后0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h重复进样，测得阿魏酸峰面积积分值的RSD为3.72%（n=5），表明供试品溶液12 h内稳定。

    2.7  加样回收率试验

    取上述已知含量的样品（批号：890906），共6份，精密称定，每份精密加入一定量的对照品，按2.2.2项下处理并测定。外标法定量，结果见表1。表1  回收率测定结果

    2.8.  样品含量测定

    取不同批号的祛痹舒肩丸，按2.2.2项下制备，分别取对照品溶液与供试品溶液各以20 μL进样，按上述色谱条件测定，外标法定量，结果分别为1.07 mg/g，1.18 mg/g，1.15 mg/g。

    3  讨论

    3.1  流动相的选择

    ［２～5］对流动相进行了选择，比较了不同组成和不同比例的流动相，最终选择乙睛-0.085%磷酸溶液（17∶83）为流动相，使待测成份分离效果好，且峰形较佳。

    3.2  波长的选择

    采用UV-1101紫外可见分光光度计，以甲醇为溶媒测定阿魏酸，在250 nm～400 nm波长绘制吸收曲线，结果在323 nm 处有最大吸收，且在(323±2) nm范围内较平坦。同时阿魏酸的紫外吸收光谱显示，以流动相为溶剂及以甲醇为溶剂时，在323 nm处有最大吸收，因此选择323 nm作为检测波长。

    3.3  提取方法的选择

    阿魏酸化学性质极不稳定，需避光保存并低温冷藏。本文对采用不同溶剂和不同超声处理时间的提取方法进行了比较［３～5］，考察了乙醇、甲醇、盐酸-乙醇（1∶20）溶液、盐酸-甲醇（1∶20）溶液4种提取溶剂，分别超声10 min、40 min、60 min，结果以盐酸-甲醇（1∶20）超声10 min提取效果最好。选用超声提取法，操作简便，提取率高，并可有效地避免了高热对阿魏酸稳定性的影响。

    用HPLC法测定祛痹舒肩丸中阿魏酸的含量，经方法学研究表明此方法具有样品预处理简单、回收率好、重现性好、稳定性好及专属性强等优点，作为祛痹舒肩丸质量标准检测方法，能够更有效地控制该制剂的质量。

【参考文献】
  ［１］ 国家药典委员会.国家药品监督管理局国家标准WS3-314(Z-046)-99(Z)［Ｓ］. 新药转正标准中药第23册,1999:752.

［２］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［Ｓ］.一部．北京:化学出版社,2005：89.

［３］ 罗先英.HPLC法测定调经止痛片中阿魏酸的含量［Ｊ］.西北药学杂志,2007,22(2):63～64．

［４］ 朱 艳,杨松松.HPLC法测定大风丸中阿魏酸的含量［Ｊ］.辽宁中医药大学学报,2007,9(3):187．

［５］ 冯 筠,唐德才.HPLC法测定肤痒片中阿魏酸含量［Ｊ］.云南中医学院学报,2007,30(1):13～14．