CpG ODN对哮喘气道MMP
[关键词]哮喘；气道重塑；寡核苷酸链；基质金属蛋白酶 9
现在研究认为哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，反复炎症刺激可引起组织损伤及后续的组织结构改变即气道重塑[1]。炎症细胞及局部结构细胞如平滑肌细胞、上皮细胞等均可分泌大量介质，诱导细胞外基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达，这些表达在哮喘的慢性病程中起重要作用[2]。含非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤的寡核苷酸链（CpGoligodeoxynuleotides, CpG ODN）能够刺激机体产生多种细胞因子及表面粘附分子，诱导细胞及体液免疫，在免疫性疾病、肿瘤及疫苗研究等方面有独特价值。本实验旨在利用卵蛋白致敏激发的小鼠慢性哮喘模型,探讨CpG ODN对气道重塑有无抑制作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂清洁级BALB/c小鼠28只, 7周龄,体重16~20g，购于扬州大学比较医学中心[许可证号：SCXK（苏）20020009]。主要试剂包括鸡卵清蛋白(ovalbumin， OVA)(Sigma公司Ⅱ级)，CpG ODN(5′TCCATGACGTTCCTGACGTT3′)(上海生物工程技术服务有限公司),兔抗基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase，MMP9）多克隆抗体（Santa Cruz公司），二抗试剂盒，3，3二氨基苯联胺（DAB），苏木素（北京中杉生物技术有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组 将28只小鼠随机分为哮喘组、CpG ODN组、地塞米松组和对照组4组，每组7只。
1.2.2 哮喘动物模型制备 小鼠于我校动物试验中心[使用许可证号：SYXK（苏）20020130]适应性饲养，温度22~27℃，湿度40%，灯光照明明暗各12h。1周后，采用卵蛋白致敏和激发建立哮喘小鼠模型[3]。哮喘组、CpG ODN组、地塞米松组分别于第0、14天腹腔注射OVA10μg加氢氧化铝2mg的生理盐水悬液0.1ml,同时CpG ODN组给予CpG ODN100μg。第15天开始以2.5%OVA雾化激发，30min・d-1,3d・周-1,共6周;地塞米松组每次激发前1h予2.5%地塞米松雾化10min;对照组全部以生理盐水代替。末次刺激后24h处死动物。
1.2.3 取材 将动物颈椎脱臼处死，迅速打开胸腔，取出左肺投入10%中性福尔马林溶液中固定24h。肺标本严格于垂直位石蜡包埋，切片，片厚5μm。
1.2.4 光镜观察及气道形态学测定 行HE染色,光镜观察肺组织病改变（观察倍数10×40）：取5个完整的支气管横断面，且气管最小径/最大径≥0.5。参照[4]应用ImagePro Plus 4.5图像分析软件测定支气管基底膜周径(Pbm)、上皮黏膜层面积(WAmuc)、平滑肌面积(WAmus)、气管内壁面积(WAi),并用Pbm标准化，分别以WAmuc/Pbm、WAmus/Pbm、WAi/Pbm表示气道重构程度。
1.2.5 免疫组化方法（SABC法）测定 一抗选用兔抗大鼠MMP9多克隆抗体，稀释度为1∶80。用二抗试剂盒进行操作,操作步骤按试剂盒说明书进行,DAB显色,苏木素轻度复染,光镜观察。阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗而其他条件均相同,用ImagePro Plus 4.5软件采取图灰度值行图像分析。
1.3 统计学处理采用SPSS13.0统计软件，数据以x-±s表示，进行t检验、单因素方差分析,两两比较用q检验。
2 结 果
2.1 肺组织病改变及图像分析光镜下观察,与对照组相比,哮喘组小鼠气道壁及气道平滑肌明显增厚,黏膜下水肿,黏膜下层增宽,管腔狭窄,有时可见黏液栓堵塞,气道上皮细胞脱落,杯状细胞增多,黏膜下及管周有大量炎性细胞浸润,有时可见淋巴滤泡。CpG ODN及地塞米松组较哮喘组上述改变明显减轻。图像分析地塞米松组和CpG ODN组WAmuc/Pbm、WAmus/Pbm及WAi/Pbm较哮喘组明显降低而高于对照组（P＜0.05)，地塞米松组和CpG ODN组两者间无显著差异(P＞0.05)。结果见表1、图1。 表1 气道形态学指标测定(略)图1 各组小鼠气道病理学改变 HE染色10×402.2 免疫组化染色 对照组小鼠MMP9在气道黏膜上皮少量表达;小鼠MMP9在气道黏膜上皮表达量哮喘组较对照组明显增强(P＜0.05)，地塞米松组和CpG ODN组较哮喘组明显减少(P＜0.05)，但高于对照组(P＜0.05)，而地塞米松组及CpG ODN组两者间无显著差异（P＞0.05）。图像分析结果见图2、图3。图2 各组小鼠气道黏膜上皮MMP9的表达 免疫组化染色 10×40图3 各组气道黏膜上皮MMP9的表达
3 讨 论
支气管哮喘是以慢性气道炎症及气道重塑为特征的一类疾病。反复炎症刺激引起的气道重塑表现为气道壁增厚、气道平滑肌增生肥大及气道壁细胞外基质各成分的改变。在这一过程中，MMP9表达增多起了重要作用[5]。糖皮质激素已作为哮喘的一线用药，研究人员认为其可能是通过控制炎症使MMP9水平下降，从而调节MMP9与其抑制物的比例来发挥作用[6]。本实验结果也提示了使用糖皮质激素后，哮喘小鼠气道重塑有所减轻，气道MMP9有所下降，但早期使用糖皮质激素不能完全抑制气道重塑，且长期吸入激素也会有副作用。含非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤的CpG ODN又称免疫刺激序列（immunostimulatory sequences ,ISS）或CpG基序（CpG motifs），基本骨架为5′PuPuCGPyPY3′，是模仿细菌DNA片段合成的，可被天然免疫系统识别，引起后续免疫反应。多项实验证明，CpG ODN在诱使Th0向Th1型细胞转化同时抑制Th2型反应。我们已在急性小鼠哮喘模型上证实CpG ODN与抗原一同作用时可诱发Th1型占优势的免疫反应[7]，现在推测这一作用可能是通过下调组织内GATA3的mRNA表达来实现的[8],但对于CpG ODN在气道重塑方面影响的报道较少。本实验中在致敏时予以注射CpG ODN，与哮喘组比较，小鼠气道各项形态学指标显示气道壁增厚减轻，气道MMP9表达有所下降，说明CpG ODN可部分抑制哮喘的气道重塑。已有实验发现，CpG ODN可通过与细胞Toll样受体9结合引起细胞内信号传导来影响NFκB活性，从而诱导小鼠的星形胶质细胞MMP9的mRNA表达下降[9]。而Toll样受体9还分布于树突状细胞、B细胞及其他一些免疫细胞上。因此，推测CpG ODN可能是通过诱导Th1型介质释放并直接与释放MMP9细胞作用来减少其表达，从而抑制气道重塑。但是这一抑制作用并不优于地塞米松，说明在哮喘的气道重塑过程中可能还有其他因素参与。总之，本实验通过抗原刺激小鼠建立慢性哮喘模型，并提示了该模型中小鼠气道重塑的存在可能与MMP9表达增高有关。CpG ODN预防性使用可部分抑制气道重塑，这一作用可能是通过调节MMP9来实现的。
[]
[1]HOMER R J, ELIAS J A. Airway remodeling in asthma: therapeutic implications of mechanisms[J]. Physiology (Bethesda),2005,20（1）:2835.
[2]BOUSQUET J，JEFFERY P K，BUSSE W B，et al. Asthma：from bronchoconstruction to airways inflammation and remodeling[J].Am J Respir Crit Care Med,2000,161（5）:17201745.
[3]TEMELKOVSKI J, HOGAN S P, SHEPHERD D P, et al. An improved murine model of asthma: selective airway inflammation, epithelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerosolised allergen[J]. Thorax,1998,53（10）:849856.
[4]BAI A，EIDELMAN D H，HOGG J C，et al. Proposed nomenclature for quantifying subdivisions of the bronchial wall[J].J Appl Physiol,1994,77（2）：10111014.
[5]SUZUKI R, MIYAZAKI Y, TAKAGI K. Matrix metalloproteinases in the pathogenesis of asthma and COPD: implications for therapy[J]. Treat Respir Med, 2004, 3(1):1727.
[6]HOSHINO M, TAKAHASHI M, TAKAI Y, et al. Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase9 and tissue inhibitor of metalloproteinase1 expression in asthma[J]. J Allergy Clin Immunol,1999,104（2）: 356363.
[7]张祖贻，杨远，张见平. CpG ODN对哮喘小Th1/Th2相关细胞因子表达的影响[J].江苏医药杂志,2002,28（3）:164166.
[8]WU Z Q, XU Y P, XIANG H, et al. Effects of CpG oligodeoxynucleotide on transcription factors GATA3 and Tbet mRNA expression in asthmatic mice[J]. Acta Pharmacol Sin,2005,26(9):11171122.
[9]LEE S, HONG J, CHOI S Y, et al. CpG oligodeoxynucleotides induce expression of proinflammatory cytokines and chemokines in astrocytes: the role of cJun Nterminal kinase in CpG ODNmediated NFkappaB activation[J]. J Neuroimmunol,2004,153(12):5063.
