阿霉素纳米粒对颅内移植G422小鼠的化疗实验研究
[关键词]纳米粒；阿霉素；胶质母细胞瘤；化疗
恶性脑肿瘤，尤其是胶质母细胞瘤（GBM）预后很差，手术、放疗、化疗等综合治疗后患者平均生存期不足1年。阻碍化疗药物发挥效果的主要障碍是血脑屏障，其他还有脑微血管内皮细胞及部分脑肿瘤细胞表达的糖蛋白P等。恶性胶质瘤具有生长迅速、弥漫性生长、广泛性脑水肿和形成新生的肿瘤血管等生物学行为特点。新生的肿瘤血管对包括大多数药物在内的大分子有高度通透性，但是这种新生的肿瘤血管是局部的，仅限于肿瘤中心，在肿瘤生长最活跃的边缘却依然是绝大多数化疗药物不能通过的完整血脑屏障。国外研究证明载药纳米粒可以借助脑血管内皮细胞表面的LDL受体转运通过完整的血脑屏障，并能逆转糖蛋白P导致的多重耐药性。体外实验证明阿霉素对恶性胶质瘤有效，然而由于阿霉素不能通过完整的血脑屏障，并且容易被糖蛋白P泵出脑组织，所以阿霉素不能充分发挥治疗恶性胶质瘤的效果。本实验考察了阿霉素纳米粒对小鼠胶质母细胞瘤模型治疗的效果并比较了其与同等剂量阿霉素生理盐水的化疗疗效。
1 材料和方法
1.1 材料纳米粒由东南大学生物医学工程系纳米技术与纳米材料实验室张宇教授惠赠，阿霉素由东南大学附属中大提供；阿霉素纳米粒及空白纳米粒由东南大学生物医学工程系纳米技术与纳米材料实验室制作。阿霉素纳米粒的直径和形态在东南大学基础医学院电镜室用透射显微镜观察。一滴纳米悬浮液放在网格覆有聚乙烯醇缩甲醛碳的铜网上室温下孵育1.5min，移除多余液体后样本用2％醋酸双氧铀阴性染色，再用透射电镜检查网格。1.2 肿瘤模型G422皮下荷瘤鼠由北京市神经外科研究所提供。昆明小鼠86只，雌雄各半，体重18~22g，由东南大学医学院实验动物中心提供。脱颈处死G422皮下荷瘤鼠，放入75％酒精中浸泡1~2min，在超净工作台内无菌切取皮下移植10d的瘤组织，放入盛有DHanks液的培养皿中。剪除瘤组织中坏死及出血部分后将瘤组织放入玻璃组织匀浆器中，加入1ml DHanks液进行彻底研磨后经80目铜网过滤，1000r・min-1离心5min后得到瘤细胞沉渣，加入1ml DHanks液吹打成瘤细胞悬液,用苔盼蓝染色计数后调制成浓度为4×106ml-1的瘤细胞悬液。参照所述方法[1]使用乙醚麻醉小鼠，用微量注射器刺穿小鼠右顶骨，进针3mm，刺入右侧大脑半球脑白质，每只注入瘤细胞悬液3μl，即每只1.2×104个瘤细胞，共接种86只昆明小鼠。
1.3 药物治疗荷瘤小鼠随机分为6组，分别为接受大剂量阿霉素纳米粒（3×2.5mg・kg-1）、中剂量阿霉素纳米粒（3×1.5mg・kg-1）、小剂量阿霉素纳米粒（3×1.0mg・kg-1）、空白纳米粒（3×2.5mg・kg-1）、阿霉素生理盐水（3×2.5 mg・kg－1）和不予任何治疗的控制组。上述药物通过尾静脉在移植后第2、5、8天3次给药。
1.4 组织学检查和流式细胞仪检测每组随机挑取1只进行组织学检查。完整的脑取出后固定在PBS福尔马林溶液（4％，pH 7.4）中12h，然后做2mm冠状切片，脱水并用石蜡包埋，做5μm厚的连续切片并进行HE染色检查。大剂量阿霉素纳米粒组、阿霉素生理盐水组和控制组分别随机挑取1只进行双染法流式细胞仪检测。完整的脑组织取出后用机械法分散成单细胞，用300目丝网过滤。取1×106制备的细胞加入5μl Annexin V 和 10μl PI，混匀后加入100μl Buffer液，置4℃冰箱避光孵育30min，然后加入Buffer液0.3ml，振荡后上机，结果运用Cell Quest软件分析。
1.5 统计学分析数据使用图表、平均生存期、95％可信区间和生存率曲线表示。数据的统计学处理使用SPSS 11.5进行分析。方法为组与组之间两总体均数间的t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 阿霉素纳米粒的特征阿霉素纳米粒的形态如图1所示。TEM显示阿霉素纳米粒的形状近似于球形，直径在20~50nm之间,其可以在水中稳定地悬浮。图1 阿霉素纳米粒TEM图 ×50000
2.2 阿霉素纳米粒对小鼠G422化疗的效果各组小鼠在接种肿瘤细胞过程中均无死亡，大剂量阿霉素纳米粒组和控制组各有2只、空白纳米粒组有1只在接种第8天前死亡，死因为接种后的颅内血肿。化疗效果见表1。表1 各组小鼠的化疗效果注：ISTc为相对于控制组的平均生存期延长率，ISTd为相对于阿霉素生理盐水组的平均生存期延长率 各组数据输入SPSS11.5统计分析之后，除了阿霉素生理盐水组与小剂量阿霉素纳米粒组、控制组与空白纳米粒组这两项比较无统计学意义之外，其他两两比较均有统计学意义。阿霉素纳米粒大剂量组的生存期最长，阿霉素纳米粒各组的荷瘤小鼠生存期与剂量呈正相关。各组的荷瘤小鼠生存率曲线如图2所示。
2.3 组织病检查结果阿霉素纳米粒大剂量组的小鼠脑组织中肿瘤边界图2 各组荷瘤小鼠的生存率曲线清楚，周边未发现明显的肿瘤细胞浸润；瘤细胞病理性核分裂少见，相对排列疏松（图3）。阿霉素生理盐水组的小鼠脑组织中肿瘤边界不清楚，周边有大量肿瘤细胞浸润，瘤细胞异型性明显、体积大、形态不一、排列紊乱、核大深染、病理性核分裂多见，瘤细胞排列紧密并可看到瘤巨细胞（图4）。图3 阿霉素纳米粒大剂量组小鼠脑组织切片 HE×100图4 阿霉素生理盐水组小鼠脑组织切片 HE×100
2.4 流式细胞仪对肿瘤细胞凋亡的检测结果控制组、阿霉素生理盐水组、阿霉素纳米粒大剂量组的凋亡百分比分别为20.04%、12.10%和10.10%（图5）。
3 讨 论
原发性脑肿瘤和脑转移瘤的患者预后很差，平均生存期仅在6个月左右。脑肿瘤的包括手术、放疗和化疗等。由于绝大多数药物通过血脑屏障的能力很差而不能在脑肿瘤组织中达到有效的药物浓度，化疗效果不佳。很多报道脑肿瘤组织中新生的血管通透性很高，难以通过正常血脑屏障的化疗药物可以通透，但是这种情况仅见于肿瘤的中心，而肿瘤生长最活跃、常常在治疗后局部复发的肿瘤头端的血脑屏障却是完整的，很多化疗药物在肿瘤头端是不能检测到的。凡是能够提高药物通过血脑屏障或避开血脑屏障的方法毫无疑问可以显著提高化疗效果。避开血脑屏障的方法如立体定向化疗、植入ommaya囊、术中瘤床给药等可以提高化疗效果，但是化疗药物在脑组织中扩散距离有限，给药点2~3cm以外的瘤组织中几乎不能检测到药物[2]。其他避开血脑屏障的给药方法如脑室内给药，扩散距离则更加有限，容易被脑脊液带入静脉。暂时开放血脑屏障的方法，如经颈内动脉灌注甘露醇，可以可逆性地开放血脑屏障，增加药物的通过，但是这种方法有些严重的问题，如大鼠实验发现颈内动脉灌注甘露醇后有脑组织的破坏[3]。RMP7等血管活性药物可以通过激活内皮细胞表面的B2受体打开脑微血管内皮细胞的紧密连接开放血脑屏障，临床二期实验治疗效果显著，但是临床三期实验已经中断。开放血脑屏障会导致对脑组织有毒性的血液中物质，如与神经递质结构类似的物质进入脑组织造成脑功能紊乱。近几年来，国内外许多研究报道载药纳米粒可以通过血脑屏障增加药物在瘤组织中的浓度，而不开放血脑屏障，从而维持了血脑屏障维护脑组织正常微环境的功能[4]。Kreuter[4]认为载药纳米粒通过血脑屏障的机制主要是结合在载药纳米粒表面的表面活性物质，如吐温80可以与血液中apo E（载脂蛋白E）或apo B(载脂蛋白B)结合，然后与脑微血管内皮细胞表面的LDLR（低密度脂蛋白受体）结合通过胞内运输进入脑组织。由于apo E或apo B对于脑组织大量需求的必需脂肪酸是必不可少的运输载体，所以脑微血管内皮细胞高度表达LDLR。因此，表面结合表面活性剂的载药纳米粒对脑肿瘤的化疗具有靶器官特异性。载药纳米粒还有一个重要的优点是可以逆转多重耐药。脑微血管内皮细胞及部分脑肿瘤细胞均高度表达糖蛋白P，大多数化疗药物都是糖蛋白P的底物，因此在脑肿瘤中都难以达到有效的治疗浓度。有作者[5]认为载药纳米粒通过掩盖药物与糖蛋白P结合的位点从而避免了被糖蛋白P泵出细胞，国内张炎等[6]发现载药纳米粒可以逆转人膀胱癌的多药耐受相关蛋白介导的耐药。本实验中阿霉素纳米粒对G422颅内移植的昆明小鼠的化疗效果有剂量依赖性，大剂量阿霉素纳米粒组较同等剂量的阿霉素生理盐水组的疗效明显增加。组织病理学检查证实，第12天时大剂量阿霉素纳米粒组的小鼠G422肿瘤直径明显小于阿霉素生理盐水组，阿霉素生理盐水组的脑肿瘤边界不清楚，周边有较多的肿瘤细胞浸润，而大剂量阿霉素纳米粒组则肿瘤边界清楚，周边几乎见不到浸润的肿瘤细胞，原因可能是肿瘤边缘血脑屏障完整，阿霉素不能通过血脑屏障从而不能杀死边缘浸润的肿瘤细胞，而阿霉素纳米粒可以通过血脑屏障在肿瘤边缘达到有效的药物治疗浓度。空白纳米粒组的荷瘤小鼠生存期相对于控制组的荷瘤小鼠无统计学意义，说明纳米粒本身对G422胶质母细胞瘤细胞没有治疗作用，阿霉素纳米粒对肿瘤细胞的治疗效果来源于阿霉素。流式细胞仪检测发现，大剂量阿霉素纳米粒组的细胞凋亡百分比低于同等剂量的阿霉素生理盐水组，阿霉素生理盐水组的则低于控制组。这个结果与预期的正好相反。Sebastian等[7]在阿霉素纳米粒治疗101/8 GBM大鼠中也发现了这样一个与预期相反的结果，他们认为原因在于选取的动物样本量不足，个体存在较大的生物学差异，也有可能是选取的时间窗并不适宜。作者认为凋亡率的下降可能原因为：（1）阿霉素纳米粒组的肿瘤细胞总量相对最少，所以凋亡的细胞绝对数量相对较少；（2）阿霉素纳米粒可以在肿瘤组织中获得较其他组明显增高的阿霉素浓度，肿瘤细胞在低浓度阿霉素条件下凋亡，而高浓度条件下则病理性死亡。上述推测是否成立，有待于扩大选取的流式细胞仪检测样本量比较上述几组的细胞死亡数量。本实验通过生存期的比较、病理学的检查证实了以纳米粒为载体可以提高小鼠脑肿瘤的化疗效果，载药纳米粒是一种充满希望的化疗方法。
[文献]
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