糖基化终产物对人肾系膜细胞MMP2表达的影响

                 作者：杨益宁，孙子林，杨涛，马婵娟，马里，刘乃丰

   [摘要]目的: 观察糖基化终产物（advanced glycosylation end products, AGEs）对人肾系膜细胞(human renal mesangial cell，HRMC)基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase，MMP2）表达的影响。方法: 运用糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGEBSA）干预体外培养的HRMC，Western blot检测系膜细胞MMP2蛋白表达。结果: HRMC的MMP2蛋白表达水平随AGEBSA浓度增加和干预时间延长而降低（P＜0.01）。结论: MMP2可能参与AGEs所致的糖尿病肾病的发生。

    [关键词] 基质金属蛋白酶；人肾系膜细胞；糖基化终产物；糖尿病肾病

     糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN）特征性的病理改变为细胞外基质（extracellular matrix, ECM）积聚和基底膜增厚。系膜基质的成分与含量决定于基质合成与降解两者之间的平衡。基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase, MMP2)是重要的ECM降解酶，它定位于肾小球，由结缔组织细胞分泌，主要参与Ⅳ型胶原的降解，而后者是DN时肾小球基底膜增厚和系膜基质堆积的主要成分，因此与DN的关系非常密切。持续高血糖状态下体内蛋白质发生非酶糖基化反应和最后形成的糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）在DN发生机制中具有重要意义，已有研究显示AGEs能降低大鼠肾小球系膜细胞MMP2表达和活性 [1]。本研究以体外培养的人肾系膜细胞(HRMC)为模型，进一步观察AGEs对MMP2蛋白表达的影响。

　1  材料与方法

    1.1  主要试剂牛血清白蛋白(AMRESCO产品), DMEM培养基(GIBCO产品，低糖型),小牛血清(兰州民海生物) ,蛋白抽提试剂（上海申能博彩）,SDSPAGE试剂(上海凯基生物),预染标准蛋白质Marker（北京天为时代）,GAPDH（上海康成）,MMP2单克隆抗体和兔抗鼠辣根过氧化酶抗体（美国Santa Cruz 公司）,DAB显色试剂（上海申能博彩）,其他试剂均为国产分析纯。

    1.2   AGEBSA的制备在pH 7.4的PBS溶液里加入BSA和葡萄糖，使BSA的终浓度为5.0g・L-1，葡萄糖的终浓度为50mmol・L-1，充分溶解后过滤除菌，37℃无菌孵育90d。孵育结束后以pH 7.4 PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖，其余条件一致。荧光光谱扫描(激发波长390nm，发射波长450nm，狭缝5nm)鉴定AGEBSA。

    1.3  细胞培养和干预HRMC株由阮雄中博士（Renal Unit，Royal Free Hospital，LONDON，UK）惠赠,将其置于37℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度培养箱。培养液为含10%小牛血清的DMEM，每2~3d更换1次培养液。将处于对数生长期的细胞按1∶3移入6孔板中，待细胞生长至80%～90%融合时换用无血清的DMEM同步化饥饿24h，按下列分组进行干预，同时设DMEM对照组及BSA对照组，3孔细胞作为1组。不同浓度的AGEBSA(50、100、200、400、800mg・L-1)与HRMC共孵育24h，浓度为200mg・L-1的AGEBSA干预HRMC 8、16、24、48和72h。

    1.4  Western blot检测MMP2蛋白表达裂解HRMC提取总蛋白，以Bradford法检测总蛋白浓度。在10%SDSPAGE分离胶上覆盖5%的积层胶, 取10μl蛋白质样品按1∶1 比例与2×加样缓冲液(0.15mo l・L -1 Tris, 10% SDS, 0.03% 溴酚蓝, pH 6.8) 混合, 95℃ 5min变性后上样。电泳后将凝胶依次进行半干电转移、5%脱脂牛奶封闭1h、一抗孵育过夜、二抗孵育、DAB显色。扫描PVDF膜并对电泳条带进行光密度分析。以GAPDH作为上样对照，靶蛋白条带密度与内参条带密度的比值作为各组实验数据，每组实验重复3次。

    1.5  统计学处理应用SPSS 11.5软件包进行统计, 数据用x-±s表示,采用oneway ANOVA进行组间比较，以P＜0.05为差异有显著性。

    2  结    果

    2.1  不同浓度的AGEBSA对HRMC MMP2蛋白水平的影响如图1所示，AGEBSA在浓度为50mg・L-1时，细胞的MMP2蛋白表达即已降低，与DMEM组和BSA(800mg・L-1)组相比，P＜0.01。并且，随着AGEBSA浓度的增高，细胞的MMP2蛋白表达进一步降低，至800mg・L-1时为最低。各AGEBSA组与DMEM组和BSA(800mg・L-1)组相比均有显著性差异，P＜0.01。BSA组与DMEM组相比无统计学差异，P>0.05。各组的MMP2/GAPDH蛋白OD比值DMEM为0.494±0.186，BSA为0.522±0.364，50mg・L-1AGEBSA为0.358±0.149，100mg・L-1AGEBSA为0.289±0.176，200mg・L-1AGEBSA为 0.287±0.209，400mg・L-1AGEBSA为0.226±0.179，800mg・L-1AGEBSA为0.209±0.130。

    2.2  AGEBSA干预HRMC不同时间对MMP2蛋白的影响如图2所示，200mg・L-1 AGEBSA干预细胞8h后MMP2蛋白表达即已降低，至16h更为明显，与DMEM组相比，P＜0.01；并且，随着AGEBSA干预时间的延长，细胞的MMP2蛋白表达进一步降低，各时间点与DMEM组相比均有显著性差异，P＜0.01。各组的MMP2/GAPDH蛋白OD比值DMEM为3.065±0.207，8h组为2.817±0.198，16h组为2.486±0.051，24h组为2.073±0.057，48h组为1.651±0.052，72h组为1.457±0.056。

    3  讨    论

　近年来，MMPs在各种原因引起的肾纤维化中的作用越来越受到关注。很多研究证实MMPs参与DN的发病机制。人类及大鼠糖尿病时肾小球ECM主要成分的mRNA和蛋白质表达以及基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）1活性明显增加, 而MMP2活性及表达下调[2]。人类、大鼠、小鼠肾系膜细胞均有MMPs表达。MMP2属于Ⅳ型胶原酶，主要降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原以及纤维连接蛋白（fibronectin,FN）和弹性蛋白等ECM。其中Ⅳ型胶原是肾小球基底膜和ECM的主要成分，与DN的关系十分密切。大量实验资料表明，糖尿病患者体内存在一种重要的毒性产物――AGEs的堆积。AGEs一旦形成即可改变酶蛋白功能，引发机体生理或病理改变。最近人们发现，由于机体主要依靠肾脏清除循环中的AGEs，在非糖尿病所致的肾功能不全患者体内也存在足以产生病理作用的AGEs，这些患者同样表现出动脉硬化过程加速的征象，提示AGEs可能是导致糖尿病及肾功能不全者血管病变一种普遍存在的致病因素。糖基化的主要目标是结缔组织基质或者基膜的结构成分，如胶原、髓磷脂、管蛋白、纤溶酶原、纤维蛋白原等等。Ⅳ型胶原富含赖氨酸和羟赖氨酸，生物半衰期很长，长期高糖环境使之发生非酶促糖基化，糖化后的胶原分子结构发生改变形成共价交联，可影响MMPs的表达和活性[3]，同时对MMPs的降解不敏感，出现所谓的抵抗现象，导致胶原在病变的肾组织中积聚而加速肾小球硬化。本研究发现AGEBSA能明显降低HRMC的MMP2蛋白表达，并且随着AGEBSA浓度增加和作用时间延长，MMP2的蛋白表达也下降，这将导致ECM积聚，引起肾小球硬化。关于AGEBSA下调MMP2表达的机制目前尚未清楚，可能涉及多种相互作用的细胞内信号转导。MMPs的活性在多个水平上受到严格调控 ,其中在转录水平上多种生长因子和细胞因子可影响其产生及mRNA稳定性，如CTGF、TNFα、IL1β、TGFβ、PDGF和IL6等。作为多种代谢和血流动力学因素导致ECM积聚的共同中介，TGFβ被认为是MMPs/TIMPs系统最重要的调控因子[4]。TGFβ可增加多种ECM成分的合成，如FN、层粘连蛋白（laminin）和蛋白多糖等。有研究表明，AGEs可诱导TGFβ表达，而后者对MMP2活性有抑制作用[5]。此外，TGFβ还促进基质分子细胞表面受体整合素表达，增强细胞基质相互作用[6]。不久前McLennan等[7]通过实验证实DN时CTGF是TGFβ作用的下游调控因子，且通过上调TIMP1的表达以剂量依赖模式抑制基质降解。本研究组晚近的研究也证明，AGEs能明显增加大鼠肾皮质促纤维化因子CTGF mRNA的表达[8]。因此我们推测，本试验观察到的AGEBSA呈剂量和时间依赖性降低HRMC的MMP2蛋白表达，有可能是通过TGFβ途径介导的。另外，TIMP是MMPs主要抑制物，4种TIMPs（TIMP1,2,3,4）均能在肾脏表达，其可抑制MMPs及其酶原的活化，从而使MMPs活性降低，胶原降解减少。作者计划今后进一步研究肾纤维化过程中TIMPs的变化。

    ［］

    [1]赵志涛，于晓燕，李才，等. 糖基化终末产物对大鼠肾系膜细胞基质金属蛋白酶2活性和表达的影响[J].吉林大学学报：医学版，2004,30(6)：843845.

    [2]DEROSA G, AVANZINI M A, GEROLDI D,et al. Matrix metalloproteinase2 may be a marker of microangiopathy in children and adolescents with type 1 diabetes[J].Diabetes Care,2004,27(1):273274.

    [3]McLENNAN S,FISHER E,MARTELL S Y,et al. Effects of glucose on matrix metalloproteinase and plasmin activities in mesangial cells:possible role in diabetic nephropathy[J]. Kideny Int,2000,58(suppl 77):S8187.

    [4]SINGH R,SONG R H,ALAVI N,et al. High glucose decrease matrix metallorpoteinase2 activity in rat mesangia cells via transforming growth factorbeta 1[J].Exp Nephrol,2001,9:249257.

    [5]BARICOS W H,CORTEZ S L,DEBOISBLANC M,et al. Transforming growth factorbeta is a potent inhibitor of extracellular matrix degradation cultured human mesangial cells[J]. J Am Soc Nephrol,1999,10:795.

    [6]ZIYADEH F N, HAN D C. Involvement of transforming growth factorbeta and its receptors in the pathogenesis of diabetic nephrology[J]. Kidney Int Suppl, 1997,60:S711.

    [7]McLENNAN S V, WANGX Y, MORENO V,et al. Connective tissue growth factor mediates high glucose effects on matrix degradation through tissue inhibitor of matrix metalloproteinase type 1: implications for diabetic nephropathy[J]. Endocrinology, 2004,145(12):56465655.

    [8]陆秀锋，陆静，刘乃丰. 氨基胍与葛根素对糖尿病大鼠肾脏结缔组织生长因子表达的影响[J].东南大学学报：医学版,2005,24(1):1317.