体外诱导生成树突状细胞的成熟度和激活性研究

                 作者：刘晓霞 贾力品 乔俊红

【摘要】  目的: 探讨人外周血单核细胞体外培养树突状细胞（dendritic cell,DC）的成熟度和激活性。方法: 从健康成人外周血分离单核细胞（PBM），加入粒单系集落刺激因子（GMCSF）1000U/ml、重组白细胞介素4（IL4）500 U/ml，体外培养7d。然后加入肿瘤坏死因子a(TNFa)100ng/ml ，体外培养3d。培养流式细胞仪分别测定两次DC的主要组织相溶性复合体（MHC）Ⅱ类分子和协同刺激分子，分析其成熟度和激活度。结果:PBM经GMCSF和IL4诱导培养7d后，细胞成簇，表型为CD83 226% 、CD86 555% 、CD11c 361% 、CD64 32%、人类白细胞抗原（HLA）DR 134% ；加入TNFa培养3d后，细胞表型为CD83 815% 、CD86 993% 、CD11c 988% 、CD64 34%、人类白细胞抗原（HLA）DR 833% 。结论: GMCSF和IL4诱导培养PBM 7d，可获得大量不成熟DC，该体系有利于DC扩增，加入TNFa继续培养3d后，DC成熟度高，激活性好。

    【关键词】  树突状细胞；体外培养；成熟度；激活性

    【ABSTRACT】  Objective: To study maturity and activation of dendritic cells (DC) induced from human peripheral blood monocytes（PBM）. Methods: The monocytes collected from nomal peripheral blood were cultured with GMCSF (1000U/ml) and IL4 (500U/ml) for 7 days, then cultured with TNFα (100ng/ml) for 3 days. MHCⅡand costimulatory molecules of DC were analyzed by flow cytometry for two times, so maturity　and activation of DC were known by them. Results: CD83、CD86、CD11c、CD64、HLADR expressions in PBM were 226%、555％、361％、32％、134％ after PBM were cultured with GM-CSF and IL4 for 7 days, but their  expressions in PBM were 815%、993%、988％、34％、833％ after PBM were cultured with TNFαfor 3 days. Conclusion: DC induced from PBM with GMCSF and IL4 for 7days were not mature, but the system inducement was beneficial to expansion of DC. Cultured with TNFαfor 3 days , DC induced form PBM were very good in maturity and activation.

    【KEY WORDS】  Dendritic cells; Culture in vitro; Maturity; Activation

    树突状细胞（dendritic cell,DC）是体内最强的抗原提呈细胞 ，免疫反应的产生首先是由抗原提呈细胞 （APC）捕获抗原，经其加工处理后将抗原信号传递给T、B淋巴细胞，从而引发一系列的免疫应答。因此，APC是机体免疫反应的首要环节，能否进行有效的抗原呈递直接关系到免疫激活和免疫耐受的诱导。成熟的DC启动免疫应答，而不成熟的DC参与免疫耐受的形成。DC通常从骨髓CD34+细胞和PBM培养获得。在此，我们探索了从PBM培养DC的成熟度和激活性的方法。

    1  材料与方法

    11  材料  淋巴细胞分离液购自Sigma公司，丝裂酶素C购自Sigma公司，RPMI1640购自GIBCO公司，胎牛血清购自GIBCO公司，rhGMCSF、rhIL4、hTNFa购自R&D公司，CD83、CD11c、CD64、CD86、HLADR、FITC标记兔抗鼠IgG荧光二抗购自华美生物工程公司。

    12  方法

    121  外周血单核细胞（PBM）的分离

    采集健康人外周血100ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，RPMI1640悬浮后种于24孔板，置于37℃，5%的CO2培养箱中，培养3h，弃去悬浮细胞，贴壁细胞即为PBM，用于DC培养。

    122  DC的培养

    含10%胎牛血清的RBMI1640悬浮PBM，1×105/ml细胞种于24孔板，2ml/孔，加入GMCSF1000U/ml、IL4500 U/ml置于37℃，5%的CO2培养箱中，饱和湿度条件下培养7d，然后加入TNFa 100ng/ml继续培养3d后，分别于7d和10d收集悬浮细胞核轻微贴壁细胞进行检测。

    123  细胞形态学观察

    分别取培养3d和7d的细胞进行光学显微镜和显微镜的观察，对其形态结构进行分析。并在细胞培养期间进行细胞集落的观察。

    124  细胞表型测定

    荧光素标记的CD83、CD86、CD11c、CD64、HLADR等单克隆抗体，采用直接荧光法标记DC后，流式细胞仪分析细胞表型，至少分析5×103个细胞。

    125  统计学方法

    两组间比较采用t检验。

    2  结果

    21  培养细胞的形态学

    在倒置显微镜下观察到,培养72h后的细胞呈圆形，散在分布，细胞无突起。以后细胞体积逐渐增大，细胞形态逐渐由圆形变为梭形、逗点状、蝌蚪状、星形或不规则形。在生长过程中，单个散在的细胞逐渐集聚成簇状细胞集落。开始集落较小，由3~5个细胞组成，以后集落逐渐增大，可达10个以上细胞。4d时，部分细胞脱落，集落变小。7d后细胞体积变大，突起明显增多，大多数细胞悬浮，贴壁较少。加入TNFa后继续培养，细胞脱落增多，脱落细胞为成熟DC（图1）。

   图1  DC体外培养不同时期的形态

    左：3d    右：7d透射电镜下：细胞表面光滑，没有微绒毛。突起呈多样化，有的呈丘状，有的呈粗短指状，有的细而长可向四周呈放射状伸出，也可盘曲呈环状，细胞核极度不规则，细胞器不发达，有少量溶酶体或缺如，但有中等量核糖体和线粒体，线粒体多呈圆形或椭圆形，常成群存在，线粒体嵴较发达。

    扫描电镜下：DC形态不规则，有许多长短不等的薄片样突起，有的薄片甚至长达数微米，DC的胞体和突起表面光滑，无明显小棘、皱褶或微绒毛（图2）。

    图2  电镜观察DC超微结构

    22  培养细胞的免疫表型

    GMCSF和IL4诱导培养PBM 7d，加入TNFa继续培养 3d后的细胞免疫表型（见表1）。培养前，CD64阳性率967%，CD83阳性率21%，同时CD86、CD11c、HLADR高表达，符合新鲜单核细胞表型。GMCSF和IL4诱导培养后，CD64阳性率32%，CD64阳性细胞明显降低（P＜001），同时CD83、CD86、CD11、HLADR低表达，符合不成熟DC表型。加入TNFa后，CD83阳性率815%，与不加入TNFa组比较，CD83阳性率明显增加（P＜005)，同时CD83、CD11c、HLADR高表达，反映DC已迅速成熟和激活。

    3  讨论 

　  体外培养DC主要有两条途径，分别为骨髓细胞来源和单核细胞来源[1]，培养时间多为5~14d。成熟的DC高表达MHCⅡ类分子（HLADR）、粘附分子（CD11c、CD1a）和协同刺激分子（CD80、CD86）；而CD83是DC活化标志，这类DC具有很强的激发同种T细胞增生的能力，肿瘤抗原冲击的DC还能致敏自体T细胞，使其对自体肿瘤细胞具有明显的杀伤活性[2]。CD14、CD64是单核细胞/巨噬细胞的标志，因而上述标志能很好的反映DC成熟度和功能状态。谢炜等[3]用细胞因子（GMCSF、 IL4和TNFa）培养PBM 7d，所获细胞CD83（457%）、HLADR（976%）；刘艳等[4]对脐血单核细胞用同样细胞因子培养8d，所获细胞CD83（502%）、HLADR（785%）；本文用类似方法培养9d，所获细胞CD83（815%）、CD86（993%）、CD64（34%），同时CD11c、HLADR高表达，且培养时间越长，细胞簇越大，细胞数量越多。这些结果提示：从单核细胞培养DC，培养时间应达到10d。表1  PBM+GMCSF+IL4，加入或不加入TNFa培养前后的细胞表型抗原阳性率（%）（n=16）注：P1值：不加入TNFa组与培养前比较；P2值：加入TNFa组与不加入TNFa组比较；P3值：不加入TNFa组与加入TNFa组比较

    目前，培养DC的方法很多，不同来源、不同培养时间和不同诱导因子所获得的DC成熟度和激活性不同。我们的结果表明：GMCSF和IL4不能诱导DC完全成熟和活化，但该体系有利于DC扩增；加入TNFa能使DC迅速成熟和激活。从PBM培养DC，采用GMCSF、IL4和TNFa诱导，培养10d，可获得大量适宜于DC免疫临床实验和基础研究的成熟度高、激活性好的DC。

    1  Titzer S,Christensen O, Manzke O,et al. Vaccination of multiple myelom a patients with idiotypepulsed dendritic cells:immunological and clinical aspects[J].Br J Haematol,2000,108:805816

    2  何学鹏，尤胜国，卞寿庚.急性髓系白血病患者诱导抗自身白血病T细胞免疫的实验研究[J].中华血液学杂志，2001，22（12）：629632

    3  谢炜，王月丹，邱玉华.人外周血树突状细胞的诱导及其生物学特性的研究[J].苏州医学院学报，1999，19（11）：11451147

    4  刘艳，朱美琪，张弘.脐血中树突状细胞的体外培养诱导和抗肿瘤效应的实验研究[J].中华妇产科杂志，2000，35（6）：352355