丹酚酸B对内皮细胞氧化损伤的保护作用及机制研究

【摘要】  目的：研究丹酚酸B对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化损伤的保护作用,并探讨其对HUVECs CD54表达和中性粒细胞黏附率的影响。方法:以H2O2为损伤剂，观察丹酚酸B对HUVECs培养上清中LDH、NO、MDA含量的影响,并利用免疫组化方法和显微计数法观察该药对H2O2存在下CD54表达和中性粒细胞黏附率的影响。结果:丹酚酸B可剂量依赖性地减少H2O2所致内皮细胞LDH外漏和MDA生成,并提高NO释放,还能有效抑制H2O2存在下CD54表达和增加中性粒细胞黏附率。结论:丹酚酸B具有减轻H2O2所致内皮细胞的氧化性损伤，降低血管内皮细胞表面细胞黏附分子表达和抑制中性粒细胞黏附的作用，这一作用可能是丹酚酸B抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机制之一。

【关键词】  丹酚酸B 内皮细胞 CD54 中性粒细胞

    丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎。丹参归心、肝经,药性微寒,味苦、无毒,具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦的功效。近年研究显示，丹参有广泛的生物活性，其心血管系统疾病的作用尤其受到关注，并已有相关药物在临床使用[1?4]。目前已有研究表明,其水溶性有效成分为治疗心血管疾病的主要药效物质基础，而丹酚酸B是其中较为重要的成分之一。目前关于丹酚酸B的研究主要集中于心肌缺血/再灌注损伤和缺氧/复氧损伤，而关于丹酚酸B对内皮细胞氧化性损伤的研究尚未见报道。鉴于血管内皮细胞所处的特殊位置（血液与间质组织间的一层半透性的屏障）及其损伤对心肌缺血/再灌注损伤的重要影响，我们研究了丹酚酸B对血管内皮细胞氧化性损伤的影响，以期为更全面了解丹酚酸B的药理作用提供相关依据。

    1  材料和方法

    1.1  药品、试剂和仪器

    丹参注射液，生药1.5  g·ml-1，正大青春宝药业有限公司，批号0405202。肝素钠注射液，常州生物千红制药有限公司，批号030212。RPMI 1640培养基，Gibco产品。新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号041030。胰蛋白酶（1∶250），Amresco分装。3%双氧水，南京兴蓝箭科技公司，批号20030901?1。乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20050225。一氧化氮（NO）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20050112。丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20050203。Rabbit Anti CD54(ICAM?1)，0.1 ml(200 μg·ml-1)，武汉博士德生物工程有限公司。即用型SABC免疫组化染色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。Percoll，100 ml(1.131 g·ml-1),北京夏斯生物有限公司，批号301944。Beckman冷冻台式离心机，美国Beckman公司。莱卡显微工作站，德国莱卡公司。精密移液器，吉尔森公司。Forma细胞培养箱，美国Forma公司。全自动高压灭菌锅，日本SANYO公司。超净工作台，苏州净化设备厂。24孔培养板，Costa公司。

    1．2  药物对H2O2所致HUVECs氧化损伤的影响

    1．2．1  HUVECs的培养及氧化损伤模型的建立[5]  HUVECs按常规方法复苏后接种于40 ml培养瓶中，培养液为含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，37℃、95% O2、5% CO2条件下培养，待细胞长满瓶底后，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃消化2～3 min，用新生牛血清终止消化。将细胞悬液移入离心管，1 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，用新鲜的RPMI 1640培养液重新悬浮细胞，将细胞浓度调整为1×108 L-1的细胞悬液，同样条件下继续培养，待细胞长满单层融合后，弃去上清，以含0.5%血清的培养液培养24 h，使其同步化生长，即可用于试验。接种于24孔板的HUVECs同步化生长后，加入含有终浓度为200 μmol·L-1 H2O2的无血清的RPMI 1640培养液，作用24 h。

    1．2．2  实验分组  （1)正常对照组：无血清的RPMI 1640培养液；（2）模型组：无血清的RPMI 1640培养液加200 μmol·L-1  H2O2作用24 h；（3）丹参注射液组：加入含有丹参注射液终质量浓度为3.0 g·L-1的培养液预孵1 h，然后换成含有200 μmol·L-1 H2O2的培养液作用24 h；（4）丹酚酸B低剂量组：加入含有丹酚酸B终质量浓度为1×10-6 g·L-1的培养液预孵1 h，然后换成含有200 μmol·L-1 H2O2的培养液作用24 h；（5）丹酚酸B中剂量组：加入含有丹酚酸B终质量浓度为1×10-5 g·L-1的培养液预孵1 h，然后换成含有200 μmol·L-1H2O2的培养液作用24 h；（6）丹酚酸B高剂量组：加入含有丹酚酸B终质量浓度为1×10-4g·L-1的培养液预孵1 h，然后换成含有200 μmol·L-1 H2O2的培养液作用24 h。

    1．2．3  细胞形态学观察及生化指标测定  各组HUVECs经H2O2处理24 h后，于相差倒置显微镜下观察其形态学变化，并检测培养液中LDH、NO、MDA含量。

    1．3  HUVECs CD54表达的测定方法

    将HUVECs按1×10-4ml-1的密度接种于预先铺有玻片（5 mm×5 mm）直径为35 mm的培养皿中，每个培养皿中4块玻片。37℃、95% O2、5% CO2条件下培养，待细胞长至80%融合后吸去上清，以含0.5%血清的培养液培养24 h，使其同步化生长，即可用于实验。

    将长满细胞的涂片从培养皿中取出，置于冰丙酮（100%）中固定10 min，晾干。将固定好的玻片用502胶固定于载玻片上，放入4℃冰箱中备用。取出4℃冰箱中的载玻片，用PBS润洗1 min，晾干。30% H2O2  1份+纯甲醇50份混合，将载玻片置于其中浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水润洗3次，晾干。滴加5% BSA封闭液，室温20 min，甩去多余液体。滴加Rabbit Anti CD54抗体，稀释度为1∶100，4℃过夜,PBS润洗3次，每次2 min。滴加生物素化山羊抗兔IgG，湿盒中37℃ 20 min，PBS润洗3次，每次2 min。加试剂SABC，37℃ 20 min，PBS润洗4次，每次5 min。使用DAB试剂盒显色，取1 ml蒸馏水加试剂A、B、C各1滴，混匀后加至载玻片，室温显色，镜下控制反应时间5～30 min，蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。

    免疫组化染色阴性对照：用PBS代替Rabbit Anti CD54抗体4℃过夜，其余步骤同上。

    每张切片在统一放大倍数40×40下，随机选取10个视野，平均单个视野CD54阳性细胞数。

    1．4  HUVECs与嗜中性多形核白细胞（PMN）黏附率的测定

    PMN的分离[6]：按所述方法将分离所得的PMN用无血清的RPMI 1640混悬，调整细胞浓度为5×108  L-1，备用。

    将HUVECs接种于24孔板中，常规培养，待细胞80%融合后，换含0.5%血清的RPMI 1640，使之同步化生长。24 h后弃去培养液，按“1.2.1”的步骤进行氧化损伤处理。取处理后细胞用PBS洗涤2次，加入1 ml的PMN悬液（其中含有5×105个PMN），于培养箱内继续培养，1 h后吸出上清，用1 ml PBS轻洗1次，将上清和PBS洗液合并，用细胞计数板计数未黏附的PMN数量。黏附率(％)=(5×105-收集PMN数）/（5×105）×100％。

    1．5  统计学处理

    所得数据用 SPSS软件进行统计学处理，结果进行Student′s?t检验。

    2  结    果

    2．1  HUVECs细胞形态学观察

    正常对照组HUVECs细胞呈棱形、三角形或多角形，融合成片后的细胞呈鹅卵石状镶嵌排列。经H2O2处理后的模型组，可见细胞体积缩小，细胞间隙明显增宽，细胞皱缩成球形，有的细胞肿胀、变圆，折光率下降，多数细胞从培养瓶壁脱落而悬浮在培养液中，部分已经自溶。经丹酚酸B预处理的HUVECs能明显地减轻H2O2对细胞形态学的改变，大部分细胞仍成片贴壁生长，细胞间隙无明显改变，部分细胞折光率降低，无明显的细胞皱缩、肿胀、变圆的现象。因此，丹酚酸B对H2O2 处理所导致的HUVECs氧化损伤具有一定的保护作用。见图1。

    2．2  丹酚酸B对H2O2所致HUVECs 上清液中LDH含量、NO释放及MDA生成的影响

    H2O2损伤使得HUVECs上清液中LDH增多，与正常对照组比较，差异显著（P<0.01）。丹酚酸B中、高剂量组可明显减少氧化损伤所致上清液中LDH的增多（P<0.05，P<0.01）。见表1。

    经过H2O2处理后，HUVECs释放的NO减少，与正常对照组比较，差异显著（P<0.05）。丹酚酸B高剂量组能有效改善损伤细胞NO的释放（P<0.05）。

    另外，由于H2O2的氧化损伤，使得HUVECs上清液中脂质过氧化产物MDA的生成明显增多，与正常对照组比较，差异显著（P<0.01），丹酚酸B高剂量组能抑制MDA的释放，使HUVECs脂质过氧化程度降低（P<0.05）。图1  丹酚酸B对H2O2处理的HUVECs形态学的影响表1  丹酚酸B对H2O2所致HUVECs上清液中LDH含量、NO释放及MDA生成的影响 HUVECs经过H2O2处理后，CD54的表达明显升高，与正常对照组比较，有显著性差异（P<0.01），并且，随着时间的延长，阳性细胞数有增多的趋势（数据未显示）。经丹酚酸B 1×10-4、1×10-5预处理的HUVECs，其CD54的表达有所抑制，与模型组比较，差异显著（P<0.05，P<0.01）。

    2.4  丹酚酸B对HUVECs与黏附率的影响

    HUVECs经过H2O2处理后，CD54表达增加的同时，PMN与HUVECs的黏附率也有所升高，与正常对照组比较，有显著性差异（P<0.01），并且，随着时间的延长，PMN的黏附率也相应增加。经丹酚酸B 1×10-4、1×10-5预处理的HUVECs，其与PMN的黏附减少，与模型组比较，差异显著（P<0.05）。

    3  讨    论

    目前，已有研究表明，血管内皮细胞不仅仅是作为血液与血管间的生理屏障而存在，还能分泌多种活性物质而对心血管系统进行调节。心脏一旦供血供氧不足，首先受到影响的感受器就是血管内皮细胞。正常的内皮功能一旦受到破坏，就可通过多种途径反过来影响心肌缺血病程的。

    血管内皮源性活性氧（ROS）的激活增多以及ROS所介导的信号转导，首先是在观察缺血再灌注损伤的病变过程中发现的[7]。在缺血再灌注导致血管内皮细胞功能损伤的机制中，内皮细胞的氧化性损伤是最主要的原因之一。内皮细胞所产生的ROS主要包括O-2、H2O2、ONOO-、NO和OH-。过氧化氢作为活性氧家族中的一员[8] ,可直接作用于膜脂质,形成脂质过氧化物,从而使MDA 生成增加,质膜通透性增加,外钙内流增多,LDH 漏出也增多;H2O2还能通过抑制Na+?K+?ATP酶活性,使胞内钙不能排出,导致钙超载,并且H2O2可直接损伤内质网及线粒体钙转移系统,使其丧失缓冲调节细胞内钙的能力。异常升高的钙可能通过启动黄嘌呤黄嘌呤氧化酶系统或花生四烯酸系统产生氧自由基及其他细胞毒物质,并可加剧线粒体功能障碍,使氧化磷酸化紊乱,导致内皮细胞损伤。

    本实验中在采用200 μmol·L-1 H2O2处理后，HUVECs培养液中LDH的含量显著增多，MDA的释放量也明显增加，这说明HUVECs确实受到了H2O2的损伤，并且脂质过氧化反应程度增加。与此同时，HUVECs培养液中NO的含量明显减少，这表明血管内皮功能出现紊乱。本实验结果表明，丹酚酸B可以降低HUVECs损伤后LDH的释放，减轻脂质过氧化程度，并有效调节NO的释放，此结果与在大鼠身上获得的结果相符合，进一步验证了丹酚酸B确实对血管内皮系统具有保护性调节作用。有研究表明，丹酚酸B具有较高的清除自由基活性,该物质所表现出来的心、脑血管疾病的作用可能与其抗自由基活性有关[9]。而本实验中丹酚酸B所显示出的对H2O2所致的内皮细胞氧化性损伤的拮抗作用印证了上述结论。

    近些年来的基础与临床研究表明,炎症反应在缺血性心脏病的发生与发展中起着至关重要的作用。无论是在充血性或是缺血性的心肌疾病中，都伴有标志炎症反应的血管内皮细胞黏附分子表达的上调。

    在心肌缺血尤其是在缺血后再灌注损伤过程中，中性粒细胞等炎症细胞与血管内皮细胞、心肌细胞发生的黏附作用可通过多种机制造成血管功能障碍及组织损伤。此外，中性粒细胞是氧自由基产生的一个重要的途径。缺血期间，中性粒细胞进入缺血组织，细胞因子转录和表达增加，白细胞聚集，促使细胞膜脱颗粒，释放蛋白水解酶，炎症浸润线粒体，致使呼吸链传递受损，耗氧量增加，所摄取的氧经NADPH氧化酶作用而形成自由基。

    CD54为免疫球蛋白超家族黏附分子，在静息状态的血管内皮细胞呈低水平表达，但在适当的环境中如自由基存在条件下，能迅速表达上调。

    本实验中利用H2O2来诱导HUVECs表面细胞黏附分子CD54的表达，结果显示经过H2O2处理后CD54的表达增加，并且随着时间的延长，表达CD54的细胞数逐渐增多。与此同时，与HUVECs产生黏附的中性粒细胞数目也随之增多。经过丹酚酸B1×10-5、1×10-4两剂量预处理后,HUVECs CD54表达明显被抑制，阳性细胞数减少，中性粒细胞与HUVECs的黏附率降低。

    本实验结果提示丹酚酸B具有减少内皮细胞氧化性损伤、降低血管内皮细胞表面细胞黏附分子表达和抑制中性粒细胞黏附的作用，这一作用可能表现在减少心肌缺血再灌注损伤炎细胞浸润，调节内皮细胞功能，改善血液流变等过程。

【】
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