复方首乌降脂通脉颗粒防治大鼠高脂血症和脂肪肝的实验研究

【摘要】  目的：研究复方首乌降脂通脉颗粒对大鼠高脂血症和脂肪肝的防治作用。方法：大鼠在小剂量四氯化碳致肝损伤的基础上，合并喂养高脂饲料复制大鼠脂肪肝模型。防治给药组分别给予不同浓度的药物，以血清总胆固醇(TC)、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶（SOD）含量为评价指标，观察药物的防治效果。结果：与大鼠脂肪肝模型组相比，复方首乌降脂通脉颗粒可以显著降低大鼠血清TC、TG、LDL、MDA、ALT和AST含量，升高SOD活性。肝脏组织及病理形态学改变均有明显的改善。结论：复方首乌降脂通脉颗粒能明显降低高脂血症大鼠的血脂水平，减轻脂肪肝形成的程度，对复合因素引起的脂肪肝有较好的防治作用。

【关键词】  高脂血症 脂肪肝 大鼠

    高脂血症是目前公认的导致脂肪肝的主要病因之一[ 1?2]，同时也是动脉粥样硬化(As)、冠心病等相关疾病的病理基础，降低血脂是预防和控制相关疾病发生的基本手段之一。目前临床上使用的多数降血脂药物是促进血液中脂质运输至肝脏进行代谢排泄，降血脂药若长期服用，则会伴有肝功能低下和肝脂质代谢障碍，易导致肝脏病变与脂肪沉积加剧[3]。因此，研究具有降血脂功能，同时不妨碍肝脏正常功能的理想药物具有重要实用价值[4]。和化学药物相比，在我国很多中药具有资源广泛、毒副作用小、调脂疗效肯定等优点，有很好的开发前景。降脂通脉胶囊是以首乌和茵陈为主药的一种新的中药复方制剂。我们的实验初步研究了复方首乌降脂通脉颗粒对大鼠高脂血症和脂肪肝的防治作用，发现其具有较显著的降血脂、保护肝脏和减轻脂肪肝形成的作用，为更广泛的临床应用提供了实验依据。

    1  材    料

    1．1  实验动物 

    清洁级SD大鼠，体重180 200 g，健康成年雄性，由南京医科大学实验动物中心提供，合格证号为 SCXK(苏)2002?0031。饲养条件为空调房间，温度18 24 ℃，相对湿度70%，12 h光照。

    1．2  药品与试剂

    复方首乌降脂通脉颗粒由江苏省药物研究所植物化学研究室提供，10 g提取物/50 g生药，批号030517；洛伐他汀由山东鲁抗医药股份有限公司生产，批号H37020089；胆固醇(生化试剂)由上海源聚生物科技有限公司提供，批号0400522；牛胆盐(生化试剂)由上海惠兴生化试剂有限公司提供，批号20040313；甲基硫氧嘧啶由常州康普药业有限公司提供，批号0206221。

    血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）采用酶法测定[5]，血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）参照试剂盒说明书，均采用美国ACE全自动生化分析仪检测其含量。上述指标测定由南京医科大学附属南京第一生化检验科完成。

    高脂饲料由79.3%基础饲料、1%胆固醇、0.5%胆盐、0.2%甲基硫氧嘧啶、10%猪油、5%黄豆、1%鸡蛋和鱼粉、2%蛋黄粉组成，由南京安立默科技有限公司提供。

    2  方    法

    2．1  动物分组与用药

    SD大鼠60只，在实验条件下喂饲基础饲料7 d，然后取尾血分别测定血清TC、TG，观察指标的正常值。根据血脂水平将大鼠分成正常对照组、脂肪肝模型对照组、防治给药各剂量组（复方首乌降脂通脉颗粒，3.0、2.0、1.0 g·kg-1）和阳性对照组(洛伐他汀5.0 mg·kg-1)6组，每组10只。参照Chojkier等[6]方法复制脂肪肝动物模型，除正常对照组大鼠给予基础饲料外，实验第1天给各实验组大鼠后肢一次性皮下注射四氯化碳植物油混合液（60%植物油和40%四氯化碳）3 ml·kg-1,同时用高脂饲料喂养造模，并从实验第1天开始，各防治给药组、阳性对照组分别给予相应剂量(10 m1·kg-1·d-1)的对应药物灌胃，正常对照组和模型对照组以等量的0.5%CMC?Na溶液灌胃，1次·d-1，连续6周。于每次灌胃前后观察大鼠皮毛、活动和食量等情况，每周称重1次，6周后全部动物麻醉下颈动脉取血，处死后取肝脏检测。

    2．2  检测指标

    2．2．1  体重、肝指数（肝湿重/体重×100%）  实验期间每日称取剩余饲料量，比较各组大鼠平均进食量、活动和毛发等情况。每周测量大鼠体重1次，比较各组大鼠体重变化情况。实验结束后称取肝重、体重，肝指数。

    2．2．2  血脂、血清SOD、MDA、ALT和AST  所有大鼠在实验第48天停喂高脂饲料，禁食12 h，于实验第49天经0.6%戊巴比妥钠35 40  mg·kg-1腹腔注射麻醉后颈动脉取血，无菌状态分离血清，测定生化指标血清TC、TG、LDA、HDL、SOD、MDA、ALT和AST。观察各给药组的血脂指标、SOD、MDA、ALT和AST，并与正常对照组、模型对照组比较。

    2．2．3  肝组织标本处理  采血后迅速剖取肝脏，在固定位置取组织块置于10%福尔马林中固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织形态、肝小叶结构、脂肪变程度、肝细胞变性和坏死、炎症细胞浸润以及纤维增生等情况。

    2．3  统计学处理

    利用Microsoft Exel统计学软件对各组结果进行处理。数据以x-±s表示，与正常对照组、模型对照组比较采用两组间均数t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

    3  结    果

    3．1  大鼠体重及肝指数的测定

    各实验组大鼠体重与正常对照组大鼠体重无明显差异，模型对照组大鼠在喂养2周后食欲有所下降，体重增长不明显，至6周时，模型组大鼠体重略低于正常组，但各组间无显著性差异。模型组肝指数明显升高，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。见表1。

    3．2  大鼠血脂测定结果

    模型对照组大鼠血清TC、TG、LDL含量均显著高于正常对照组（P＜0.001）；与模型对照组比较，各实验组大鼠血清TC、TG、LDL含量均有不同程度降低，且差异显著（P＜0.05或P＜0.01），防治给药小剂量组大鼠血清TC、TG含量有降低，但差异不显著。其中防治给药大剂量组降低幅度最大，但与阳性对照组相比，差异不显著（P＞0.05）。各实验组对HDL无影响。见表2。表1  复方首乌降脂通脉颗粒对大鼠体重及肝指数的影响 1）与正常对照组比较，P＜0.01表2  复方首乌降脂通脉颗粒对大鼠血清TC、TG、HDL和LDL的影响

    3.3  大鼠血清ALT、AST变化情况

    模型对照组大鼠血清ALT、AST显著高于正常对照组（P＜0.01），防治给药中剂量、大剂量组与模型对照组比较，大鼠血清ALT、AST均有显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。防治给药小剂量组与模型对照组比较，大鼠血清ALT、AST没有显著降低（P＞0.05），阳性对照组与模型对照组比较，大鼠血清ALT、AST没有显著降低（P＞0.05）。见表3。表3  复方首乌降脂通脉颗粒对大鼠血清ALT和 AST的影响

　　3.4  大鼠血清SOD和MDA变化情况

    模型对照组与正常对照组比较，大鼠血清MDA显著升高（P＜0.01），SOD显著降低（P＜0.01），防治给药各剂量组与模型对照组比较，大鼠血清MDA均有降低，且差异显著（P＜0.01），以防治给药大剂量组降低幅度最大。防治给药各剂量组与模型对照组比较，大鼠血清SOD均升高，且差异显著（P＜0.01或P＜0.05）。见表4。表4  复方首乌降脂通脉颗粒对大鼠血清SOD和MDA的影响

　　3.5  大鼠肝脏形态学的改变 

    肉眼观察正常对照组大鼠肝脏无异常变化。模型对照组大鼠肝脏体积明显增大，包膜紧张，部分肝脏呈奶黄色，切面油腻。与正常对照组比，防治给药各剂量组大鼠肝脏颜色红润，被膜光滑，质地接近正常肝组织。

    光镜下，正常对照组大鼠肝脏基本无异常情况。与模型对照组大鼠比，防治给药各剂量组大鼠肝细胞的脂肪变性、炎症反应都有所减轻，肝细胞核周围脂肪空泡明显减少，汇管区、肝小叶内有少量炎症细胞浸润，未见点状坏死，肝小叶结构清晰，细胞索排列较整齐，但未能恢复至正常对照组水平。详见图1。

    4  讨    论

    脂肪肝是由于多种因素导致脂肪过量，以肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。中医根据其发病特点及临床表现大多归属于“积证”、“瘀证”、“痰浊”和“胁痛”等病证范围。其理论认为本病的发病机制与肝脾肾功能失调密切相关，痰湿、痰热、痰瘀内生，气滞瘀积，阻塞脉道，清阳不升，浊阴不降是其主要病理基础[7]。

    根据《本草纲目》等资料记载，首乌味苦、甘、涩，性温，归肝、肾二经，其具有“养血益肝，固精益肾”等作用。药理研究表明，首乌富含卵磷脂、蒽醌类化合物，其主要药理作用有：（1）蒽醌类可以促进胃肠蠕动，减少胆固醇的吸收；（2）卵磷脂参与肝脏HDL的合成，促进TG和胆固醇的代谢[8]；首乌中的四羟基乙烯?β?D?葡萄糖甙是保肝的有效成分，它能防止脂肪肝、肝功能损害和肝脏过氧化脂质含量升高，降低血清ALT和AST。此外，首乌增加肝糖原的作用也有利于对肝脏的保护[9]。茵陈性味苦、辛，微寒，归肝、胆、脾、胃经，有清热利湿、利胆退黄、护肝祛脂等功效。药理实验研究结果表明，茵陈有明显的降酶护肝作用。茵陈含有丰富的锌、锰等机体所必需的微量元素，这些微量元素参与酸的组成，调节酶的活性，直接参与机体的核酸、糖、脂肪、蛋白质代谢，因而有促进肝细胞再生，保护肝细胞膜的完整性和明显的保肝降酶作用[10]。 复方首乌降脂通脉颗粒是以上述两味中药为主药的复方制剂，对高脂血症合并脂肪肝具有良好的防治作用。

    本实验以在小剂量四氯化碳致肝损伤的基础上，合并喂食高脂饲料的方法复制高脂血症大鼠脂肪肝动物模型。四氯化碳在肝脏中通过过氧化作用，阻断载脂蛋白的合成，使脂肪在肝内沉积，同时用含高脂肪的饲料喂养动物，提供部分外源性脂肪，以加快、加重脂肪肝的形成[11]。此种造模过程周期短且模型稳定，其特点为：（1）体重、肝指数明显增加；（2）血脂水平、肝功能转氨酶明显升高；（3） 肝组织学呈大泡性脂肪变，伴有小叶和汇管区炎症，甚至碎屑样坏死。以上特点适合本课题的研究。复方首乌降脂通脉颗粒可抑制实验性高脂血症大鼠体重的增加，并可显著降低实验性高脂血症大鼠血清TC、TG和LDL含量且呈一定量效关系，大剂量复方首乌降脂通脉颗粒与洛伐他汀的调脂疗效相当。高脂血症所致脂肪肝为非酒精性脂肪肝，因脂肪代谢紊乱，过量的脂肪在肝内持久积聚，导致肝脏脂肪变性。本实验发现复方首乌降脂通脉颗粒可降低肝指数、血脂含量和转氨酶，减轻病理改变等，说明其具有显著抑制高脂血症引起的实验大鼠脂肪肝形成的作用。

    现代药理研究结果表明，脂肪肝的形成及其后续的整个过程与脂质过氧化损伤有着密切的关系[12]。正常情况下，TG在外周脂肪组织和肝脏之间不断循环，保持平衡。由于高脂血症是脂质和脂蛋白代谢紊乱的后果，代谢平衡失调，机体产生过多的氧自由基(oxygen free radical，OFR)4，脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸在OFR的作用下发生自我氧化反应，并产生大量的自由基，这就是所谓的脂质过氧化。脂质过氧化的主要作用是降低细胞膜的流动性，从而改变细胞膜的特性和明显破坏膜结合蛋白。脂质过氧化在细胞膜的发生，破坏了细胞膜对脂肪的转运机制，为大量脂肪在肝细胞内的堆积提供了条件[13]。SOD是机体内重要的抗氧化剂，可消除过剩的OFR及其衍生物，保护细胞免受损伤。脂质过氧化物(例如MDA)为过氧化物脂质的降解产物，其高低间接反映机体细胞受自由基供给的严重程度。

    本实验观察结果亦表明，高脂血症模型对照组大鼠的血清MDA显著高于对照组，SOD显著低于对照组，其原因可能是脂质、磷脂、游离脂肪酸和胆固醇转化利用发生障碍，已发生脂质过氧化反应。 同时观察到，与模型对照组比较，防治给药各剂量组SOD含量均升高,MDA的含量明显降低，提示复方首乌降脂通脉颗粒能够降低体内自由基活性，加强抗氧化酶活性，减少脂质过氧化反应终产物MDA的产生，从而具有一定的调节和改善自由基代谢平衡、抗氧化和保护肝细胞的作用。

    四氯化碳致肝损伤模型是筛选具有保肝降酶作用药物的常用模型之一[14l，并以血清转氨酶为观察指标来评价被筛选药物的保肝降酶效果。四氯化碳在肝微粒体内经还原活化而产生自由基，通过脂质过氧化物的破坏，肝细胞细胞膜结构和功能受到损害，使细胞内ALT、AST溢出至血液导致ALT、AST等活性升高，转氨酶活性的高低与肝实质细胞受损的程度一致，也是肝细胞损伤的敏感指标[15]。通过测量血液中ALT、AST活性可反映肝细胞损害的程度及肝细胞的修复情况。在我们的实验中，模型对照组大鼠ALT、AST明显升高，表明模型对照组大鼠肝功能严重受损。复方首乌降脂通脉颗粒能降低大鼠血清ALT、AST含量，提示具有抗肝细胞损伤，排毒保肝作用。作用原理可能是通过减轻对肝细胞膜结构和功能完整性的破坏，达到缓解肝细胞变性坏死的作用。另外，阳性对照组大鼠亦可见ALT、AST有不同程度的升高，据报道，他汀类药物的动物试验及临床研究均有肝脏酶轻微的升高，他汀类药物最重要的副作用是肝脏和肌肉毒性，且与剂量相关，在临床应用时要求监测肝功能[16]。这也提示本方对防治高脂血症脂肪肝具有有效、低毒的优势。

    在我们实验中观察到的复方首乌降脂通脉颗粒能够降低大鼠血清中的脂质含量，并且减轻肝脏中脂质过氧化反应，降低血清转氨酶含量，明显改善组织病理形态学，说明复方首乌降脂通脉颗粒具有多种机制，可以发挥其多靶点、多成分协同作用的特点，其主要机制可能是通过保护肝细胞,增强肝脏对脂质的清除能力而达到作用，对防治高脂血症脂肪肝显示出了较好的应用前景，值得进一步深入研究。

【】
  [1]陈灏珠．实用内[M]．11版．北京：人民卫生出版社，2004：991?1866．

[2]廖华，杜晓锋．高脂血症与脂肪肝的相关性研究[J]．误诊学杂志，2002，2(9)：1363.

[3]COMAR K M，STERLING R K.Review article：drug therapy for non?alcoholic fatty liver disease[J]．Aliment Pharmacol Ther，2006,23：207?215.

[4]曾民德．降血脂药物在脂肪肝中的应用[J]．中华肝脏病杂志，2000，8(2)：l16?117.

[5]鄢盛恺.关于临床血脂测定的建议[J].中华检验医学杂志,2003,26（3）:182?184.

[6]CHOJKIER M,LYCHE K D，FILIP M．Increased production of collagen in vivo by hepatocytes and nonparenchym al cells in rats with carbon tetrachloride?induced hepatic fibrosis[J]．Hepatology，1988，8(4)：808?814.

[7]苏菁，徐宗佩.中医高脂血症治疗进展[J].时珍国医国药，2006，17（7）：1287?1288.

[8]AHN K S，KIM J H，OH S R，et al.Inhibitory activity of stilbenes from medicinal plants on the expression of cell adhesion moleculeson THP1 cells[J].Planta Med,2000，66(7): 641?644.

[9]刘治军，张丽，李林.中药何首乌的药理作用研究进展[J].专家中华名医论坛,2004,(5):1727?7663.

[10]谢田，牛孝亮，刘占滨.茵陈的药理作用及临床应用进展[J].黑龙江中医药,2004，4：50?52.

[11]杨英昕，毕秀丽，朱培庭.非酒精性脂肪肝动物模型研究纂要[J].中医药学刊,2005，23（4）：647?651．

[12]吴强，彭西，崔恒敏.动物脂肪肝发病机理的研究进展[J].家禽科学,2006，（4）：46?48.

[13]张卓，李道本．脂肪肝与脂质过氧化[J]．中国中西医结合消化杂志，2003，11(4)：251?252.

[14]赵艳玲，蔡光明，刘军，等．正交试验法优选小鼠四氯化碳肝损伤模型[J]．解放军药学学报，2001，17(4)：215?217．

[15]仲来福，张瑾岗，张富勤,等.四氯化碳致大鼠肝损伤的机理[J].中国药与毒理学杂志,1989，3(4)：298?303.

[16]郑幼兰，朱惠，黄庆标，等.他汀类药物调脂作用研究进展[J].海峡药学，2002，14（6）：3?5.