乙丙昔罗中杂质限量检查方法的研究
作者：杨辉 张桂明 李秀荣 郑立卿 张嫡群
【摘要】 目的：探讨薄层层析法（TLC）用于乙丙昔罗中杂质限量检查的效果。方法：以硅胶GF254薄层板为吸附剂，石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸（1.0∶0.5∶0.04,v/v）为展开剂,检测波长254nm,比较供试品与杂质斑点的大小和颜色。结果：产品所含杂质量小于1%。结论：该方法可用于乙丙昔罗的杂质限量检查，效果良好。
【关键词】 乙丙昔罗；杂质限量；薄层层析法
【ABSTRACT】 Objective: To set up a TLC method for the determination of the impurities in efaproxiral. Methods: SG GF254 for thin?layer chromatography was used as the stationary phase；Petroleum ether: acetic ether: glacial acetic acid(1.0∶0.5∶0.04,v/v)were used as the mobile phase；The UV detection wave was set at UVL 254nm. The size and color of the spot of the production and the impurity on the TLC were Compared. Results: The impurity quantity contained in the product is less than 1%. Conclusion: The method can be applied to the determination of the impurities in efaproxiral.
【KEY WORDS】 Efaproxiral; Determination of impurities; TLC
2?[4?[[(3,5?二甲基苯胺基)羰基]甲基]苯氧基]?2?甲基丙酸（乙丙昔罗，RSR13,efaproxiral，结构见图1）是由美国Allos therapeutics公司研制开发的新药。作为癌症放、化疗时的联合用药，人体实体瘤如脑肿瘤、乳腺癌脑转移、非小细胞肺癌脑转移等，同时也用于治疗心肌梗死、脑中风等缺血、缺氧性疾病[1,2]。本品进入血液后，以非共价键的形式与血红蛋白结合，引起血红蛋白三维结构的变化，降低血红蛋白对氧的亲和力，促进氧释放到缺氧组织中去。乙丙昔罗仅对缺氧组织有效，而不影响正常组织[3]。是目前所合成的变构血红蛋白调节剂中与血浆蛋白结合最弱、生理活性最强的化合物[4]，目前，该药正处于临床研究中。
图1 乙丙昔罗在药物合成中，除主成分药物外，还可能有原料、中间体、反应副产物等杂质。因此，必须对杂质含量加以控制，并对杂质的类型、归属进行研究。在乙丙昔罗的合成中，可能存在中间体（4?[[(3,5?二甲基苯胺基)羰基]甲基]苯酚）或瑞穆－梯曼（Reimer?Timann）反应产生的芳醛等杂质。本文建立了薄层层析法（TLC）用以检测和控制产品中的杂质。
1 材料和方法
1.1 仪器与试药
YOKO?ZF 三用紫外线分析仪（武汉药科新技术开发公司），硅胶G板（自制），硅胶GF254板（自制），4?[[(3,5?二甲基苯胺基)羰基]甲基]苯酚(中间体，自制，纯度为99.25%)，乙丙昔罗供试品（自制），乙丙昔罗对照品（自制，纯度99.88%）
1.2 方法
1.2.1 检出条件的确定及专属性试验
取适量、等量中间体及乙丙昔罗对照品，分别溶于甲醇中，制成0.01mg/mL溶液，各吸取8μL，分别点于同一硅胶G薄层板及同一硅胶GF254薄层板上，于254nm及365nm紫外灯下检视。硅胶GF254薄层板上所点样品在254nm紫外光下呈暗斑，而硅胶G薄层板所点样品在254nm及365nm紫外光下均不显荧光或暗斑。因此，选择硅胶GF254薄层板为吸附剂。
吸取上述溶液各8μL点于同一硅胶GF254薄层板上，分别以①石油醚∶氯仿∶冰醋酸（1.0∶0.54∶0.04），②石油醚：二氯甲烷：冰醋酸（1.0∶0.95∶0.04），③石油醚∶甲醇∶冰醋酸（1.0∶0.4∶0.04），④石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸（1.0∶1.0∶0.01），⑤石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸（1.0∶0.5∶0.04）为展开剂展开，吹干。结果发现石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸（1.0∶0.5∶0.04）为展开剂时，原料与产品分离度Rs=3.6，中间体Rf=0.48，产品Rf＝0.37，Rf大小适宜，分离度好，因此选择此溶剂系统为展开剂。
1.2.2 最低检测限试验
取RSR13溶于甲醇中，制成浓度为①(6.08mg/mL),②(3.04mg/mL),③(1.52mg/mL),④(0.76mg/mL),⑤(0.38mg/mL),⑥(0.19mg/mL)的溶液，吸取上述溶液各8μL点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸（1.0∶0.5∶0.04）为展开剂展开，吹干，结果显示最低检测限为3.04μg，示意图见图2。
2007年10月杨 辉等：乙丙昔罗中杂质限量检查方法的研究第5期2007年10月河北北方学院学报（医学版）第5期1.2.3 杂质限量检查
精密称取供试品0.1520g，置于2mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，以甲醇定容，制成浓度为76mg/mL的溶液，作为供试品溶液。
精密量取供试品溶液1.00mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容；精密量取0.5mL于10mL容量瓶中，加甲醇定容，制成浓度为0.38mg/mL的溶液，作为对照溶液1[5]。
精密称取中间体0.1520g，置于2mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，以甲醇定容，制成浓度为76mg/mL的溶液，精密量取1.00mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容；精密量取0.5mL于10mL容量瓶中，加甲醇定容，制成浓度为0.38mg/mL的溶液，作为对照溶液2[5]。
依照中华人民共和国药典2005版(二部)附录Ⅵ B[5]薄层色谱法规定进行实验。吸取上述溶液各8μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸(1.0∶0.5∶0.04)为展开剂展开，吹干，置紫外灯(254nm)下检视供试品溶液杂质斑点的数量，并与对照品溶液1的主斑点比较,结果示意图见图3。
2 结果
供试品溶液在紫外灯(254nm)下，显两个杂质斑点，并且均明显浅于RSR13主斑点。说明产品所含杂质浓度明显小于RSR13溶液的浓度。杂质限量检查 结果表明：产品所含杂质量小于百分之一。
3 讨论
3.1 乙丙昔罗在甲醇中最大紫外吸收波长是209.5nm和247nm，在确定检出条件时，因为所得产品无荧光，选择硅胶GF254薄层板为吸附剂，样品在254nm紫外光下呈暗斑，此方法不如在暗板上显荧光的方法灵敏度高。
3.2 用石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸(1.0∶1.0∶0.01)为展开剂，也可以达到较好的分离度,但是当点样浓度较大时，产物主斑点产生严重拖尾。石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸(1.0∶0.5∶0.04)为展开剂，则可消除拖尾现象，同时保证适当的分离度及Rf值。
3.3 硅胶GF254薄层板为吸附剂，石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸（1.0∶0.5∶0.04）为展开剂，可保证在相同浓度下，RSR13与杂质斑点的大小、颜色基本一致。
3.4 TLC中Rf＝0.40的斑点既不是中间体，又不是产品，可能是瑞穆—梯曼（Reimer?Timann）反应产生的芳醛。
【】
1 Shaw E,Scott C,Suh J,et al. RSR13 plus cranial radiation therapy in patients with brain metastases: comparison with the radiation therapy oncology group recursive partitioning analysis brain metastases database/[J/]. J Clin Oncol,2003,21: 2364?2371
2 Weiss RG,Mejia MA,Kass DA,et al. Preservation of canine myocardial high?energy phosphates during Low?flow ischemia with modification of hemoglobin?oxygen affinity/[J/]. J Clin Invest,1999,103: 739?746
3 Ramnarayan SR,Mona AM,Mehanna AS,et al. Allosteric modifiers of hemoglobin：desirn,synthesis,testing,and structure allosteric activity relationship of novel hemoglobin oxygen affinity decreasing agents/[J/]. J Med Chem,1991，34(2): 752?757
4 Khandelwal SR,Randad RS,Lin HM,et al. Enhanced oxygenation in vivo by allosteric inhibitors of hemoglobin saturation/[J/]. Am J Physiol,1993，265(34): 1450?1453
5 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典·二部/[M/].2005版.北京:化学出版社,附录VI B：31?32
